摘要：目的 探尋導(dǎo)致豚鼠自身免疫性梅尼埃病（autoimmune Meniere's disease，AIMD）模型的內(nèi)耳組織抗原成分中相對(duì)分子質(zhì)量為58 000的蛋白質(zhì)成分。方法 雙向凝膠電泳方法分離豚鼠內(nèi)耳組織抗原成分，用ImageMaster圖像分析軟件選擇相對(duì)分子質(zhì)量為58 000的蛋白質(zhì)點(diǎn)，對(duì)這些蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，通過Mascot軟件查詢Swiss-prot數(shù)據(jù)庫，利用PathwayStudio軟件對(duì)查詢到的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得引起豚鼠自身免疫性梅尼埃病的主要蛋白。結(jié)果 獲得重復(fù)性和分辨率都較好的雙向電泳圖譜，軟件分析相對(duì)分子質(zhì)量58 000蛋白共獲得20個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)；質(zhì)譜分析后查詢數(shù)據(jù)庫鑒定得到11個(gè)蛋白質(zhì)。這些蛋白分別與免疫、凋亡和分化等功能相關(guān)，其中凝血因子C從相對(duì)分子質(zhì)量、Mascot評(píng)分和蛋白功能等方面綜合評(píng)估結(jié)果提示其可能作為相對(duì)分子質(zhì)量58000蛋白中引起豚鼠自身免疫性梅尼埃病的主要蛋白抗原。結(jié)論 成功獲得豚鼠自身免疫性梅尼埃病模型主要內(nèi)耳抗原成分中相對(duì)分子質(zhì)量58 000蛋白的雙向凝膠電泳圖譜，并應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)點(diǎn)。綜合分析提示凝血因子C可能為相對(duì)分子質(zhì)量58 000蛋白中引起豚鼠自身免疫性梅尼埃病的主要蛋白。

關(guān)鍵詞：梅尼埃??；自身免疫；內(nèi)耳抗原

自身免疫性內(nèi)耳疾?。╝utoimmune inner ear disease，AIED）是臨床上極少數(shù)治療效果較好一類內(nèi)耳疾病，自身免疫性梅尼埃病（autoimmune Meniere's disease，AIMD）屬于自身免疫性內(nèi)耳疾病（autoimmune inner ear disease，AIED）的一種。本項(xiàng)目組前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，相對(duì)分子質(zhì)量為58 000的內(nèi)耳組織抗原為導(dǎo)致豚鼠AIMD的主要抗原成分之一[1，2]。本研究擬對(duì)豚鼠內(nèi)耳組織中相對(duì)分子量58 000的抗原采用蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)，進(jìn)行分離鑒定，為AIMD在特異性抗原方面的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康、白色、紅目豚鼠3只，3月齡，雌雄不限，體重250～300g，由南京市江寧青龍山動(dòng)物繁殖場提供，豚鼠耳廓反射正常，耳鏡檢查排除中耳疾患。

1.2試劑與儀器

1.2.1蛋白質(zhì)提取、雙向電泳 固相pH梯度膠條（24cm，pH3～10NL）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、APS、Tris、超純尿素、DTT、硫脲、CHAPS、載體兩性電解質(zhì)（Pharmalytes pH3～10）、膠槽清洗液、凝膠覆蓋液、碘乙酰胺、低熔點(diǎn)瓊脂糖、溴酚蘭；BCA試劑盒；十二烷基磺酸鈉；蛋白酶抑制劑cocktail、37%甲醛；分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（130、95、72、55、43、34、26kD）；甘油、無水乙醇、冰醋酸、無水乙酸鈉、碳酸鈉、硫代硫酸鈉、硝酸銀、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA.Na2）、磷酸、蔗糖、濃鹽酸均為國產(chǎn)分析純；所有溶液均用去離子水配制。

1.2.2質(zhì)譜分析 乙晴，碳酸氫胺，三氟乙酸，序列修飾后胰蛋白酶。MALDI-MS質(zhì)譜儀BIFLEXⅣ。

1.2.3免疫印跡法試驗(yàn) PVDF膜（Millipore Corporation）；化學(xué)發(fā)光試劑盒（Cell Signaling Technology，Inc）。CS-15R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；Bio-Rad ModeL 680垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)移槽；

1.3方法

1.3.1抗原制備 制備豚鼠內(nèi)耳組織抗原[3]，方法：清醒狀態(tài)下斷頭，取聽泡，分離膜迷路（主要包括螺旋韌帶、基底膜、膜半規(guī)管、橢圓囊和球囊），置于150μl裂解液（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，40mmol/L Tris，65mmol/L DTT，2%IPG緩沖液，1%Cocktail，去離子水），經(jīng)剪切、超聲粉碎及均漿，12000 r/min 4℃離心5min，取上清貯于-80℃?zhèn)溆谩Ｓ肂CA法測蛋白質(zhì)濃度。

1.3.2雙向凝膠電泳 第一相固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）等電聚焦主要參照G？紫rg等[4]的方法進(jìn)行，簡述：采用pH3～10NL，24cm干膠條，每份以120μg內(nèi)耳抗原總蛋白質(zhì)與水化液（8mol/L尿素、20mmol/LDTT、2%CHAPS、0.5%IPG緩沖液以及0.001%溴酚蘭）充分混合，總體積450μl。用IPGphor等電聚焦儀，進(jìn)行第一向等電聚焦，在20℃下自動(dòng)運(yùn)行。

1.3.3凝膠染色和掃描及圖像分析 雙向電泳后的2-DE膠，為了制備蛋白用于質(zhì)譜分析而采用硝酸銀染色。染色后的雙向電泳凝膠用ImageScannerTM掃描儀進(jìn)行透射掃描，數(shù)字化圖象文件運(yùn)用Amersham Pharmacia公司的ImageMasterR 2D Elite（Version 2.00）軟件分析。比較3次重復(fù)結(jié)果圖譜，獲得標(biāo)準(zhǔn)圖譜。選擇相對(duì)分子質(zhì)量為58 000的20個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.4質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫查詢 選取2-DE凝膠上相對(duì)分子質(zhì)量為58 000的20個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在圖像上做好標(biāo)記，編號(hào)為1～20。20個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在經(jīng)過切膠、脫色、干膠后進(jìn)行酶切、點(diǎn)樣。得到的肽質(zhì)量指紋圖譜利用Mascot搜索引擎（http：//www.matrixscience.com//mascot/cgi/search_form.pl？FORMVER=2SEARCH=PMF）進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，其中蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫選擇SwissProt庫。結(jié)合雙向電泳圖譜上相應(yīng)點(diǎn)的等電點(diǎn)、分子量綜合分析。

2結(jié)果

2.1二維電泳及凝膠分析結(jié)果：電泳后的凝膠圖譜呈現(xiàn)良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，經(jīng)圖像軟件分析相對(duì)分子質(zhì)量為58 000的共有20個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)（圖1）。將這20個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)從1～20依次編號(hào)，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜分析。

圖1 豚鼠內(nèi)耳組織抗原雙向凝膠電泳圖譜

1～20分別為相對(duì)分子質(zhì)量為58kD的20個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。

2.2質(zhì)譜結(jié)果及生物信息學(xué)分析 將這20個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，以基質(zhì)峰和酶自動(dòng)降解峰進(jìn)行校正，獲得各蛋白點(diǎn)的肽片斷質(zhì)量指紋圖譜。用Mascot搜索引擎在SwissProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢，結(jié)合雙向電泳圖譜上相應(yīng)點(diǎn)的表觀等電點(diǎn)、分子量綜合分析，前17個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)被成功鑒定，部分蛋白質(zhì)點(diǎn)得到同一種蛋白，總共獲得11個(gè)蛋白（圖2）。第一個(gè)蛋白點(diǎn)得到兩個(gè)蛋白，其余各點(diǎn)都為一個(gè)蛋白；1、7、9、10、15和17六個(gè)點(diǎn)都得到凝血因子C，從相對(duì)分子質(zhì)量、Mascot評(píng)分和蛋白功能等方面綜合評(píng)估，凝血因子C可能為58kD蛋白中引起豚鼠自身免疫性梅尼埃病的主要蛋白。

圖2 質(zhì)譜分析后在SwissProt數(shù)據(jù)庫搜索到的蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)點(diǎn)1～17經(jīng)分析得到結(jié)果，第一個(gè)蛋白點(diǎn)為混合點(diǎn)，分別得到兩個(gè)蛋白，其余各點(diǎn)為一個(gè)蛋白。

3討論

內(nèi)耳自身免疫性病理損傷在感音神經(jīng)性聾（sensorineural hearing loss，SNHL）、梅尼埃病（Meniere's disease，MD）等內(nèi)耳疾病的發(fā)生及其病理機(jī)制中可能起著重要作用[5，6]。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)多種內(nèi)耳抗原在AIED的發(fā)病中起重要作用，對(duì)這些內(nèi)耳抗原的研究將有助于找到敏感而特異的血清學(xué)檢測方法，作為臨床診斷的重要依據(jù)。

之前的研究初步篩選出分子量為68KD、58KD、42KD、28KD的蛋白質(zhì)可能是致內(nèi)耳自身免疫病理損傷的主要抗原成分[1]，發(fā)現(xiàn)68kD蛋白中引起豚鼠自身免疫性梅尼埃病的主要蛋白為波形蛋白[7]。本研究擬對(duì)豚鼠內(nèi)耳組織中相對(duì)分子量58KD的抗原采用蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)，進(jìn)行分離鑒定，為AIMD在特異性抗原方面的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。我們用雙向凝膠電泳方法分離豚鼠內(nèi)耳組織抗原成分，用ImageMaster圖像分析軟件選擇獲得20個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為58kD的蛋白質(zhì)點(diǎn)，對(duì)這些蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，通過Mascot軟件查詢Swiss-prot數(shù)據(jù)庫，最后得到11個(gè)蛋白，其中六個(gè)點(diǎn)都得到凝血因子C。

58kD蛋白在自身免疫性內(nèi)耳疾病的研究中非常重要，而其成分究竟為何仍存在爭議，Boulassel[8]等發(fā)現(xiàn)多種內(nèi)耳疾病患者血清可以與58kD內(nèi)耳蛋白反應(yīng)進(jìn)而通過實(shí)驗(yàn)推斷58kD蛋白是COCH5B2蛋白。凝血因子C同源物（coagulation factor C homology，COCH）基因是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)伴前庭功能障礙的常染色體顯性遺傳非綜合征性耳聾基因，在耳蝸和前庭組織中有高度表達(dá)，COCH基因突變可致患者出現(xiàn)漸進(jìn)性感音神經(jīng)性耳聾、前庭功能障礙癥狀[9]。

過去研究表明自身免疫因素是內(nèi)耳疾病的病因之一，但這些免疫介導(dǎo)的聽力損失尚缺乏明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)，主要依賴聽力學(xué)損害、免疫試驗(yàn)陽性及應(yīng)用激素治療有效來判斷。我們項(xiàng)目組將對(duì)這些內(nèi)耳抗原繼續(xù)研究，進(jìn)而找到敏感而特異的血清學(xué)檢測方法。

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編輯/申磊