摘要：目的 探討新型重組人血管內(nèi)皮抑素（恩度）聯(lián)合欖香烯注射液對小鼠腹水瘤細胞株H22的作用。方法 ①CCK-8檢測恩度、欖香烯及兩者聯(lián)合對H22細胞增殖的作用。②ELISA檢測藥物對H22細胞上清液中VEGF和MMP-2含量的影響。③Western-Blot檢測藥物對H22細胞中VEGF、MMP-2蛋白表達的影響。結(jié)果 ①恩度對H22細胞的抑制率在4～8%，有劑量依賴性無時間依賴性；欖香烯對H22細胞的抑制率在10～40%，具有時間、劑量依賴性；恩度不能增強欖香烯對H22細胞增殖的抑制作用。②恩度和欖香烯均能抑制H22細胞上清液中VEGF和MMP-2的含量，聯(lián)合后增強該作用。③恩度和欖香烯可抑制H22細胞中VEGF和MMP-2蛋白表達，兩者聯(lián)合能增強該作用。結(jié)論 恩度聯(lián)合欖香烯不能協(xié)同抑制H22細胞的增殖，可協(xié)同抑制VEGF和MMP-2蛋白的表達。

關(guān)鍵詞：重組人血管內(nèi)皮抑素；欖香烯；腹水瘤細胞；體外實驗

既往動物實驗發(fā)現(xiàn)[1]，新型重組人血管內(nèi)皮抑素（恩度）聯(lián)合欖香烯注射液可協(xié)同抑制荷H22腹水瘤小鼠腹水形成，本實驗繼續(xù)探討了恩度和欖香烯體外對H22腹水瘤細胞的作用。

1資料與方法

1.1細胞株和試劑 小鼠肝癌H22細胞株由中國科學(xué)院上海細胞所提供，在含10%新生小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基及37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。重組人血管內(nèi)皮抑素（恩度）原液（10g/L，批號：YY2011008）由先聲藥物有限公司提供。欖香烯注射液（5g/L，批號：0909211）由大連金港藥業(yè)提供。RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司。CCK-8檢測試劑盒：KGA317，購自凱基生物。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、β-actin抗體購自Abcam公司。小鼠VEGF和MMP-2檢測試劑盒購自RD公司。

1.2方法

1.2.1對數(shù)生長期的H22細胞按1×105/mL接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)箱中孵育24h。設(shè)組如下：陰性對照組（RPMI1640培養(yǎng)基）、欖香烯單藥組（200ug/ml、100ug/ml和50ug/ml）、恩度單藥組（100ug/ml、50ug/ml、25ug/ml）及恩度和欖香烯三個濃度兩兩聯(lián)合，每組6個復(fù)孔。藥物作用24h和48h后按CCK-8說明書檢測細胞活性，計算抑制率。

1.2.2取對數(shù)生長期的H22細胞按1.2.1的方法孵育細胞并設(shè)組如下：對照組（RPMI1640培養(yǎng)基）、恩度組（100μg/ml）、欖香烯組（200μg/ml）和聯(lián)合組（恩度100μg/ml+欖香烯200μg/ml）。加藥48h后離心，-80℃凍存細胞，取上清液按ELISA說明書檢測。

1.2.3 將1.2.2離心出的細胞裂解，裂解液在4℃下13000g×15min離心并蛋白定量。樣品經(jīng)凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%的脫脂奶粉室溫下封閉1h，棄封閉液加一抗4℃孵育過夜。將膜與二抗室溫下?lián)u蕩孵育1h，漂洗10min×4次。顯影后在凝膠成像系統(tǒng)下成像。

2結(jié)果

2.1恩度對H22細胞增殖的抑制率不超過8%，有劑量依賴性、無時間依賴性。欖香烯對H22細胞增殖的抑制具有時間、劑量依賴性。各聯(lián)合組與相應(yīng)的欖香烯單藥組比較，抑制率無明顯差別（P>0.05）；與相應(yīng)恩度單藥組比較，抑制率明顯提高（P<0.05），見表1，表2。

2.2各組細胞上清液中VEGF和MMP-2水平，見表3和圖1。恩度和欖香烯抑制H22細胞分泌的VEGF和MMP-2，當恩度與欖香烯聯(lián)合后，進一步加強了該作用。

圖1 H22細胞上清液VEGF和MMP-2水平

2.3恩度和欖香烯單藥及聯(lián)合作用于H22細胞48h后，細胞內(nèi)VEGF和MMP-2蛋白的表達見圖2。恩度和欖香烯均下調(diào)了H22細胞中VEGF和MMP-2蛋白表達，兩藥聯(lián)合后進一步抑制其表達。

圖2 各組H22細胞中VEGF和MMP-2蛋白的表達

3討論

惡性腹水是晚期腫瘤的常見并發(fā)癥，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和生存時間，治療頗為棘手。血漿內(nèi)蛋白等物質(zhì)通過腹膜微血管網(wǎng)滲透入腹膜腔是惡性腹水形成的重要原因，VEGF刺激腹膜新生血管的形成、增加腹膜血管的通透性，間接促進腹水形成。

VEGF是一種內(nèi)源性的血管形成抑制因子，通過抗血管生成作用阻止腫瘤生長轉(zhuǎn)移。恩度是我國自主研發(fā)的新多種型重組人血管內(nèi)皮抑素，具有更高的生物活性和穩(wěn)定性，聯(lián)合放化療治療多種實體瘤，胸腹腔內(nèi)灌注治療惡性胸腹水亦獲良效。欖香烯注射液是從莪術(shù)中提取的抗腫瘤中藥，其主要有效成分為 β-欖香烯，能直接抑制殺傷多種腫瘤細胞、誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成[6]。

前期動物實驗中恩度聯(lián)合欖香烯可協(xié)同抑制荷瘤小鼠惡性腹水產(chǎn)生，延長小鼠生存時間。本研究發(fā)現(xiàn)，欖香烯對H22細胞具有強大的抑制殺傷作用，有時間、劑量依賴性，而恩度只有微弱的抑制作用，聯(lián)合應(yīng)用不能增加欖香烯對H22細胞的抑制率。一般認為抗血管生成藥物對體外培養(yǎng)的腫瘤細胞作用微弱，有學(xué)者研究恩度聯(lián)合阿霉素對人骨肉瘤細胞株OS-732增殖的影響，發(fā)現(xiàn)僅在短期內(nèi)（72 h）對細胞有7-10%的抑制作用。也有文章報道，恩度在高濃度下（400 μg/ml）對肝癌HCCLM6細胞的抑制率達40%。恩度對腫瘤細胞增殖的影響可能與細胞類型有關(guān)，在超出臨床劑量的極高濃度下有一定的抑制作用。VEGF通過與內(nèi)皮細胞表面特異性受體--VEGFR-1和VEGFR-2結(jié)合促進內(nèi)皮細胞有絲分裂，刺激血管生成。MMP-2是鋅離子依賴的蛋白水解酶，可降低細胞外基質(zhì)、破壞基底膜，與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。恩度和欖香烯對H22細胞上清液和細胞內(nèi)的VEGF、MMP-2蛋白均有抑制作用，聯(lián)合后其抑制作用進一步加強。恩度以血管內(nèi)皮細胞為靶點，通過抗血管生成作用抑制瘤體生長，體外培養(yǎng)的細胞僅依靠彌散作用獲得養(yǎng)分，恩度可能通過抑制VEGF、MMP-2等細胞因子抑制了H22細胞的遷移、粘附，間接調(diào)控腫瘤細胞生長。

綜上所述，恩度聯(lián)合欖香烯沒有增強對腫瘤細胞的殺傷作用，但兩者均可抑制腫瘤VEGF、MMP-2的表達，聯(lián)合用藥后增強該作用，印證了動物實驗的結(jié)論，為臨床應(yīng)用提供更充分的依據(jù)。

參考文獻：

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[3]曲文書，秦叔逵，吳窮，等.重組人血管內(nèi)皮抑制素抑制內(nèi)皮細胞血管生成的實驗研究[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2008（13）：307-312.

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編輯/申磊