摘要：目的 采用聚苯乙烯高效液相色譜法檢查頭孢地尼中聚合物的方法。方法 色譜柱為聚苯乙烯凝膠為填料的TSKgel G2000SWxl（7.8 mm×300 mm 5um）色譜柱，流動(dòng)相為0.1 mol/L，pH=7.0緩沖溶液-甲醇（95∶5），流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)285 nm，通過(guò)HPLC-ESI-MS法鑒定高分子雜質(zhì)峰，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行推定。結(jié)果 頭孢地尼在0.0002～1.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系（r=1.0000）最小檢測(cè)濃度為0.2 ug/mL，聚合物雜質(zhì)與頭孢地尼能有效分離，并先于主峰流出，方法專屬性良好，樣品在溶液中不穩(wěn)定，需臨用新配。結(jié)論 建立的方法快速準(zhǔn)確。適用于頭孢地尼及其聚合物的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；聚苯乙烯凝膠；頭孢地尼；聚合物；β-內(nèi)酰胺類抗生素；過(guò)敏原

頭孢地尼為半合成的第三代口服頭孢菌素，屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，具有抗菌譜廣、療效高、毒性低等特點(diǎn)。β-內(nèi)酰胺抗生素是目前臨床上最常用的抗感染藥物[1]。研究證明，引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的過(guò)敏原不是抗生素本身，而是其中的高分子雜質(zhì)，因此國(guó)內(nèi)外對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的高分子雜質(zhì)的控制非常重視。2010版中國(guó)藥典已有22個(gè)品種43個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的控制[2]。

中國(guó)藥典2010年版已采用葡聚糖G-10自身對(duì)照外標(biāo)法對(duì)大部份常用注射用頭孢類抗生素進(jìn)行了高分子雜質(zhì)控制，也有文獻(xiàn)報(bào)道使用葡聚糖G-10用于頭孢地尼聚合物的測(cè)量[3]。葡聚糖G-10可以手工填裝，也有商品化色譜柱，使用該填料的分離的色譜峰拖尾嚴(yán)重，不利于該產(chǎn)品聚合物的測(cè)定。日本藥典（JP）對(duì)頭孢卡品酯采用以苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為基礎(chǔ)的TSKgel G2000 色譜柱進(jìn)行聚合物控制。也有文獻(xiàn)報(bào)道使用國(guó)產(chǎn)的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為基礎(chǔ)的，以分子排阻為主要分離機(jī)制，用于測(cè)定頭孢呋辛酯中高分子聚合物的檢查[4]。

因此我們采用苯乙烯為填料的TSKgel G2000SWxl色譜柱。

1儀器與試藥

液相色譜儀，檢測(cè)器： Waters2998，溶液輸送泵：Waters2695，柱溫箱：Waters Corporation工作站：Empower版本6.20。

2色譜條件

色譜柱，TOSOH TSKgel G2000SWxl （300mm）；柱溫：35℃恒溫。流速：0.5 mL/min。

3溶液的制備

3.1對(duì)照品溶液的制備 取頭孢地尼對(duì)照品適量，精密稱定，用0.1 mol/L pH=7.0緩沖液制成含頭孢地尼對(duì)0.01 mg/mL的溶液。

3.2供試品溶液的制備 取樣約品10 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加0.1 mol/L pH=7.0緩沖液稀釋至刻度搖勻。

4色譜條件的選擇與優(yōu)化

4.1流動(dòng)相組成的選擇 去頭孢地尼對(duì)照品適量，精密稱定，用pH=7.0緩沖溶液稀釋成1 mg/mL的溶液，在25℃放置48 h，精密量取10 μL，分別用表1中的四種流動(dòng)相進(jìn)行分析，色譜圖如圖所示，用頭孢地尼主成分與其檢出雜質(zhì)、分離度、峰面積及總分析時(shí)間為分析指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)上述五種色譜系統(tǒng)中，0.1 mol/L pH=7.0緩沖溶液-甲醇（95∶5），作為流動(dòng)相時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)最優(yōu)，故選用0.1 mol/L pH=7.0緩沖溶液-甲醇（95∶5）作為流動(dòng)相，見(jiàn)圖1。

4.2流速的影響 在0.1 mol/L pH=7.0緩沖溶液-甲醇（95∶5）色譜系統(tǒng)中，考察選流速對(duì)色譜分離的影響，結(jié)果顯示流速為1.0ml/min時(shí)，雜質(zhì)峰與主成分峰不能有效分離，當(dāng)流速降為0.5 mL/min時(shí)，各峰的分離度良好，雜質(zhì)峰的保留時(shí)間為22.067 min主峰流出在25.010 min之后，在30 min內(nèi)，完成一個(gè)樣品分析，典型的色譜圖，見(jiàn)圖2。

4.3柱溫的影響 取供試品溶液按2.1項(xiàng)下的方法，分別在25℃、35℃、50℃下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果在35℃時(shí)主成分與雜質(zhì)鋒的分離效果和對(duì)稱性最優(yōu)。

5專屬性考察

5.1聚合物的結(jié)構(gòu)鑒定 采用LC-ESI-MS法，測(cè)定系統(tǒng)適用性考察用溶液中高分子聚合物的分子量，通過(guò)對(duì)待測(cè)樣品LC分析，樣品中有少量雜質(zhì)峰，根據(jù)相關(guān)文件報(bào)道，猜測(cè)其是頭孢地尼的低聚物。對(duì)強(qiáng)度較大的813.0，791.0，828.9峰分析，它們分別對(duì)應(yīng)與二聚加鈉峰，二聚加鉀峰，見(jiàn)圖3。

5.2強(qiáng)力破壞樣品中聚合物的分離 取本品原料適量，分別經(jīng)強(qiáng)酸（0.1 mol/L HCl）沸水浴，強(qiáng)堿（0.1 mol/L NaOH）沸水浴， 過(guò)氧化氫沸水浴，加熱破壞處理，光照，綜合后分別用流動(dòng)相稀釋成0.2 mg/mL的供試品溶液。取10 uL按上述色譜條件進(jìn)行分離。結(jié)果表明，在上述色譜系統(tǒng)下，各種破壞試驗(yàn)均能使聚合物峰增大，以堿破壞和氧化破壞最為明顯，各峰分離度良好。溶劑不干擾頭孢地尼及其高分子雜質(zhì)的測(cè)定。表明該方法的專屬性良好。

5.3輔料的干擾 取空白輔料，按片劑的配方除主成分外的混合輔料，按3.1供試液制備的方法配制空白輔料溶液，搖勻，取續(xù)濾液。立即精密量取10 uL，按照樣品測(cè)定方法測(cè)定，結(jié)果表明，在該色譜條件下輔料在286 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下均不出峰，對(duì)高分子雜質(zhì)的色譜行為不產(chǎn)生干擾。

5.4線性與范圍 精密稱取頭孢地尼對(duì)照品適量，用0.1 mol/L pH=7.0緩沖液稀釋制成每1 mL中含頭孢地尼分別為0.0005、0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1和1.5mg的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10 uL，用2.1的色譜條件測(cè)定。以頭孢地尼的峰面積（A）對(duì)其濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得線性方程A=65099678.3C-109555.5結(jié)果表明，頭孢地尼在0.0002～1.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系r=1.0000。

5.5精密度 取連續(xù)進(jìn)樣6次，1 mg/mL的對(duì)照品溶液，測(cè)峰面積，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差RSD為0.32%，表明方法精密度良好。

5.6最低檢測(cè)限 精密量取頭孢地尼對(duì)照品適量用0.1 mol/L pH=7.0緩沖液溶解，逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣10 uL，按S/N=3作為檢測(cè)限，記錄色譜圖，最低檢測(cè)濃度約為0.2 ug/mL，靈敏度良好。

5.7供試品濃度與聚合物測(cè)定結(jié)果性關(guān)系考察 按3.1配制供試品溶液分別用0.1 mol/L pH=7.0緩沖液稀釋制成0.01、0.02.、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5mg的溶液，搖勻，精密量取10 uL按樣品測(cè)定方法測(cè)定，結(jié)果表明在0.01～1.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，聚合物峰面積與頭孢地尼主峰相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)為r=1.0000。

5.8樣品測(cè)定 精密稱取頭孢地尼片樣品粉末適量，用0.1 mol/L pH=7.0緩沖液稀釋并制成約含1 mg/mL的溶液。按文中所提的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，3批樣品測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表2。

6討論

以苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為基礎(chǔ)的TSKgel G2000該色譜柱以分子量排阻為主要分離機(jī)制，有別于其他聚合物基質(zhì)的色譜填料，具有耐高壓，耐酸堿的特點(diǎn)，對(duì)水溶性和有機(jī)溶劑流動(dòng)相均適用。今后可以適用于其他β-內(nèi)酰胺類抗生素中聚合物的測(cè)定。

在PDA全波長(zhǎng)掃描下，檢測(cè)系統(tǒng)適用性溶液，所得雜質(zhì)及主成分的最大吸收在285 nm，主成分峰的最大吸收為285 nm，故選擇285 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。較之普通聚合物采用單一檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm更具有合理性

參考文獻(xiàn)：

[1]金少鴻，胡昌勤，仇士林，等.β-內(nèi)酰胺類抗生素過(guò)敏反應(yīng)的研究[J].醫(yī)學(xué)研究通訊，2002，31（4）：22-23.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典，2010二部附錄VH[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2012.

[3]謝贊，陳玉潔，李坤，等.凝膠色譜法測(cè)定頭孢地尼的聚合物[J].中國(guó)抗生素雜志，2011，36（3）：214-215.

[4]侯玉榮，袁耀佐，張玫，等.高效凝膠色譜法測(cè)定頭孢呋辛酯及制劑中高分子雜質(zhì)的含量[J].藥物分析雜志，2012，32（2）：267-268.編輯/張燕