摘要：目的 探討一種快速、準(zhǔn)確運(yùn)用于臨床檢測MTHFR基因多態(tài)性的方法。方法 提取43例胃癌患者的外周血基因組DNA，用TaqMan探針技術(shù)對MTHFR基因的C677T和A1298C兩個多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分型，并采用直接測序法對TaqMan探針分型結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 43例樣本的MTHFR C677T基因型分別為14例CC、23例CT和6例TT；A1298C基因型為24例AA、18例AC、1例CC，兩種分型方法結(jié)果一致。結(jié)論 本研究選用的TaqMan探針分型方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能夠用于MTHFR的C677T和A1298C兩個多態(tài)性位點(diǎn)分析。

關(guān)鍵詞：TaqMan探針；MTHFR；多態(tài)性；DNA測序；胃癌

胃癌（Gastric cancer）是世界范圍內(nèi)的高發(fā)腫瘤之一[1]。近年研究表明，低葉酸水平可增加包括胃癌在內(nèi)的許多腫瘤發(fā)生的危險性[2]。亞甲基四氫葉酸還原酶（methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR）是葉酸代謝途徑中的一 關(guān)鍵酶，MTHFR參與的體內(nèi)同型半胱氨酸（Hcy）和甲硫氨酸之間的循環(huán)反應(yīng)，反應(yīng)中生成的S腺苷甲硫氨酸（SAM）是體內(nèi)代謝唯一的甲基供體，涉及DNA的修復(fù)與合成，影響DNA代謝，與許多腫瘤化療藥物的療效相關(guān)。

MTHFR的活性很大程度上可能受基因多態(tài)性的影響，從而影響疾病的發(fā)生和藥物的療效。MTHFR基因C677T和A1298C為兩個常見的多態(tài)性位點(diǎn)，有研究表明該位點(diǎn)的基因多態(tài)性會導(dǎo)致MTHFR酶活性的改變[3]，可能導(dǎo)致患者之間出現(xiàn)較大的個體差異。因此，測定MTHFR的基因型對疾病的預(yù)防和合理用藥有重要的意義?，F(xiàn)已有的MTHFR基因多態(tài)性的研究，大多數(shù)采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）技術(shù)，該技術(shù)不僅費(fèi)時，且易污染造成假陽性。不適宜用于臨床檢測。本研究旨在探討一種可用于臨床快速準(zhǔn)確檢測MTHFR基因型的方法，故選用TaqMan探針技術(shù)對MTHFR的C677T和A1298C兩個多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分型。

1資料與方法

1.1一般資料 經(jīng)CT、MRI或病理組織學(xué)活檢確診的胃癌患者43例，來源于昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，收集樣本人群的外周靜脈血2 mL。采用Genomic DNA Purification Kit（PROMEGA公司）對基因組DNA進(jìn)行提取，使用Nanodrop 2000測定DNA的濃度和純度。

1.2 TaqMan探針技術(shù)檢測MTHFR基因C677T和A1298C位點(diǎn)的多態(tài)性 TaqMan探針試劑由ABI公司為MTHFR基因C677T（SNP ID：rs1801133），A1298C（SNP ID：rs1801131）多態(tài)性設(shè)計(jì)的TaqMan SNP分析試劑，每個位點(diǎn)的TaqMan SNP基因分型試劑中，含有兩條MGB探針。MTHFR C677T一條以VIC熒光標(biāo)記堿基G，對應(yīng)樣本基因突變位點(diǎn)C；一條以FAM熒光標(biāo)記堿基A，對應(yīng)樣本基因突變位點(diǎn)T。MTHFR A1298C一條以VIC熒光標(biāo)記堿基G，對應(yīng)樣本基因突變位點(diǎn)C；一條以FAM熒光標(biāo)記堿基T，對應(yīng)樣本基因突變位點(diǎn)A。探針序列，見表1。

MTHFR C677T及A1298C多態(tài)性 real-time PCR采用25 μL反應(yīng)體系：40×SNP Genotyping Assay Mix：0.625μL；TaqMan 2×PCR Master Mix：12.5 μL；DNA模板：1 μL；dd H2O：10.875 μL。探針檢測在BIO-RAD IQ5實(shí)時熒光PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃，15 s；60℃，1 min，共40個循環(huán)。由于儀器的限制，本研究使用的BIO-RAD IQ5實(shí)時熒光PCR儀中沒有VIC熒光檢測通道，我們選擇了HEX熒光通道替代，兩種熒光相差1nm波長。

1.3 DNA測序法驗(yàn)證TaqMan探針技術(shù)檢測MTHFR基因多態(tài)性

1.3.1目的片段的擴(kuò)增 設(shè)計(jì)MTHFR C677T及A1298C兩個多態(tài)性位點(diǎn)的測序引物（Invitrogen公司合成），引物序列，見表2。

2結(jié)果

2.1 Taqman探針基因型分析 MTHFR C677T和A1298C real-time PCR散點(diǎn)圖基因分型結(jié)果分別，見圖1、圖2。

2.2 DNA測序驗(yàn)證 采用Lansergene SeqMan軟件分析測序結(jié)果。

2.3 MTHFR基因多態(tài)性分型結(jié)果 43例樣本MTHFR C677T基因型分別為野生純合型CC 14例（32.5%）、突變雜合型CT 23例（53.5%）及突變純合型TT 6例（14.0%）。A1298C基因型分別為AA 24例（55.8%）、AC 18例（41.9%）、CC 1例（2.3%）。本研究中，TaqMan探針技術(shù)檢測及DNA測序驗(yàn)證，兩種檢測方法得到的基因分型結(jié)果一致。

3討論

中國是個胃癌高發(fā)的國家，每年新發(fā)病例數(shù)占全球總數(shù)的40%。胃癌化療方案眾多且無標(biāo)準(zhǔn)方案，目前臨床應(yīng)用最廣泛的是基于氟尿嘧啶類藥物的化療方案，在實(shí)際的化療過程中，氟尿嘧啶類藥物的個體差異較大，氟尿嘧啶類藥物在體內(nèi)均需轉(zhuǎn)化為5-FU，繼而發(fā)揮抗腫瘤作用。MTHFR是5-FU代謝中的一個關(guān)鍵酶，5-FU的活性代謝產(chǎn)物還原型葉酸（CH2FH4）在MTHFR的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基四氫葉酸，使CH2FH4與胸腺嘧啶核苷酸合成酶（TS）、三磷酸氟尿嘧啶脫氧核苷（FdUTP）組成的三元復(fù)合物減少，從而削弱5-FU的抗腫瘤作用。

C677T突變產(chǎn)生丙氨酸被纈氨酸取代的錯義突變，其合成的蛋白質(zhì)會出現(xiàn)熱穩(wěn)定性降低和酶活性的改變[4]。有研究提出，MTHFR基因的C677T多態(tài)性通過影響DNA甲基化和核酸穩(wěn)定性，參與了胃癌的發(fā)生。A1298C突變使得編碼后谷氨酰胺被丙氨酸替代，有報道稱[5]純合子突變型可使酶活性降低到正常值的60%左右。因此，測定MTHFR的基因型對腫瘤患者的個體化用藥具有至關(guān)重要的意義。

但是，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室多應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）的方法檢測MTHFR的基因多態(tài)性，該方法需要用凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，易造成樣本間污染，影響結(jié)果判讀。TaqMan探針技術(shù)省時、簡單、準(zhǔn)確、安全、實(shí)時分析是它突出的優(yōu)點(diǎn)[6]。同時，TaqMan探針在閉合單管中進(jìn)行檢測，避免了由樣本間污染造成假陽性的結(jié)果[7]。

在我們的研究中，為了進(jìn)一步驗(yàn)證TaqMan方法的準(zhǔn)確性，我們進(jìn)行了DNA測序驗(yàn)證，與TaqMan探針基因分型結(jié)果相比較，發(fā)現(xiàn)結(jié)果完全一致。本研究采用的TaqMan探針分型方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠，故我們認(rèn)為使用TaqMan技術(shù)為MTHFR C677T及A1298C基因多態(tài)性分型可用于臨床檢測。TaqMan探針基因檢測法具有很好的臨床實(shí)用性，是臨床快速診斷MTHFR基因型較有價值的方法。

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編輯/肖慧