摘要：目的 了解拉薩地區(qū)大腸埃希菌臨床分離菌株產(chǎn)ESBLs情況及其主要基因型分布。方法 參照2009年CLSI推薦方法對拉薩市臨床醫(yī)院細菌感染性疾病臨床標(biāo)本中分離所獲56株大腸埃希菌進行ESBLs表型檢測及確證，采用PCR擴增法檢測TEM、SHV、CTX-M型ESBLs基因在試驗菌株中的分布。結(jié)果 56株大腸埃希菌臨床菌株中共檢出產(chǎn)ESBLs菌株22株，檢出率為39.29%；PCR擴增分析顯示TEM、SHV、CTX-M型ESBLs基因檢出率分別為40.91%、27.27%、4.55%。結(jié)論 拉薩地區(qū)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌檢出率略低于國內(nèi)其他地區(qū)，ESBLs基因型以TEM型和SHV型為主。

關(guān)鍵詞：拉薩；大腸埃希菌；ESBLs

自20世紀(jì)40年代以來，隨著各類抗生素的研制和廣泛使用，細菌的耐藥性也廣泛出現(xiàn)。目前，細菌耐藥已成為一個全球性的公共衛(wèi)生問題。大腸埃希菌是臨床細菌性感染的常見病原菌，占臨床細菌感染標(biāo)本總檢出構(gòu)成比的18，3%，居首位[1]，其抗生素耐藥的重要機制之一為超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended spectrumβ-lactamases，ESBLs）的產(chǎn)生。ESBLs是指由質(zhì)粒介導(dǎo)的能賦予病原菌對頭孢菌素類（如頭孢噻肟、頭孢三嗪和頭孢他啶等）和單酰胺酶類抗生素、氨曲南以及青霉素耐藥的一類β-內(nèi)酰胺酶，主要分為五類：TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型及其他型，其中TEM、SHV、CTX-M型最為常見，不同地區(qū)ESBLs基因分布類型不盡相同[2]。為了解拉薩地區(qū)臨床大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs及其主要基因型分布情況，本研究對拉薩市2010～2012年三家臨床醫(yī)院細菌感染性疾病臨床標(biāo)本中分離所獲的56株大腸埃希菌進行了ESBLs表型檢測，并對其ESBLs基因型進行分析，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1資料與方法

1.1菌株 本院病原生物學(xué)實驗室2010～2012年自西藏自治區(qū)第二人民醫(yī)院、拉薩市人民醫(yī)院及婦幼保健院細菌感染性疾病臨床標(biāo)本（類型包括：痰液、尿液、化膿性傷口分泌物、膿腫液、血液等）中分離所獲大腸埃希菌56株，菌種鑒定及藥物敏感性試驗質(zhì)控菌株ATCC25922，購自衛(wèi)生部臨床微生物檢驗中心，本院病原生物學(xué)實驗室保存。

1.2主要材料及儀器 藥敏紙片、MH瓊脂購自英國Oxoid公司，在有效期內(nèi)使用。細菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq Plus PCR MasterMix、DNA Marker、Goldview、瓊脂糖為北京天根生物產(chǎn)品。ATB Expression 菌種鑒定儀（法國生物梅里埃），PCR擴增儀及電泳凝膠成像系統(tǒng)（美國BIORAD公司）。

1.3菌種鑒定和藥敏試驗 采用ATB Expression 菌種鑒定儀對試驗菌株進行鑒定，56株試驗菌株均為大腸埃希菌。參照2009年美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）推薦的Kirby-Bauer紙片擴散法進行抗菌藥物敏感性試驗及雙紙片擴散法進行表型確證。CAZ和CAZ/CLA及CTX 和CTX/CLA兩組紙片中任何一種紙片抑菌圈直徑比相應(yīng)不含克拉維酸紙片抑菌圈直徑≥5mm，則判定為產(chǎn)ESBLs菌株。

1.4耐藥基因檢測

1.4.1模板DNA的制備 取適量產(chǎn)酶菌株普通瓊脂平板過夜培養(yǎng)菌落混懸于5ml無菌 0.9%NaCl溶液中，12000rpm離心5min棄上清，其后步驟按照細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明書進行。制備之基因組DNA -80℃存放備用。

1.4.2 PCR引物及PCR反應(yīng) 根據(jù)Genebank報道的各型ESBLs基因序列設(shè)計TEM、SHV及CTX-M基因擴增引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列及擴增預(yù)期片段大小見表1。反應(yīng)體系25μl，包括2×Taq Plus PCR MasterMix 15μl，上下游引物各1.5μl，模板DNA 2μl，去離子水5μl。各基因PCR擴增條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性1min，退火30s（TEM、SHV及CTX-M基因退火溫度分別為56℃、52℃及56℃），72℃延伸1min，40個循環(huán)，末次循環(huán)72℃延伸5min，反應(yīng)結(jié)束后4℃放置。

1.4.3瓊脂糖凝膠電泳 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測各ESBLs基因PCR擴增產(chǎn)物，凝膠成像儀拍照并進行分析。

2結(jié)果

2.1 ESBLs檢出率 共檢測大腸埃希菌56株，檢出產(chǎn)ESBLs菌株22株，占39.29%。其中CAZ、CAZ/CLA組，CTX、CTX/CLA組檢出率分別為35.71%（20/56）和33.93%（19/56），兩組均檢出者有17株。

2.2 PCR擴增結(jié)果及基因型分布 部分產(chǎn)ESBLs菌株TEM、SHV、CTX-M基因PCR擴增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。擴增所獲片段大小與設(shè)計一致。22株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌中TEM型陽性9株，SHV型陽性6株，CTX-M型陽性1株，TEM+SHV型陽性4株，所占產(chǎn)ESBLs菌株比例分別為40.91%（9/22）、27.27%（6/22）、4.55%（1/22）和33.33%（4/22）。

3討論

隨著第三代頭孢菌素的廣泛使用，產(chǎn)ESBLs菌株檢出率也在不斷地增多。ESBLs主要由腸桿菌科細菌產(chǎn)生，尤以大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌最為多見。產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌株和肺炎克雷伯菌株不僅對第一、二、三代頭孢菌素耐藥， 而且對氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類等交叉耐藥。目前，產(chǎn)ESBL 菌株引起的耐藥已經(jīng)成為全球最重要的醫(yī)院內(nèi)耐藥問題之一，給臨床治療和預(yù)防帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

本研究共檢測臨床分離大腸埃希菌菌株56株，產(chǎn)ESBLs陽性22株，產(chǎn)ESBLs檢出率為39.29%。其表型確證實驗結(jié)果顯示，以CAZ、CAZ/CLA組檢出模式陽性率最高，占35.71%；兩組均陽性者占30.36%。該結(jié)果較國內(nèi)其他地區(qū)50%～70%的大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs檢出率低[3]。抗菌藥物的大量使用是細菌形成耐藥性甚至多重耐藥的重要誘因，不同地區(qū)及醫(yī)院使用三代頭孢菌素類的種類、數(shù)量及時間等不盡相同，臨床菌株的耐藥表型亦會存在差異。由于西藏地處祖國邊陲，三代頭孢菌素使用相對較少且品種較為單一，這可能是導(dǎo)致拉薩地區(qū)臨床大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs檢出率低于國內(nèi)其他地區(qū)的主要原因。

ESBLs基因型分布結(jié)果顯示，22株ESBLs表型確證陽性的菌株中TEM型和SHV型分別占40.91%和27.27%，為拉薩地區(qū)臨床產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的主要基因型，CTX-M型僅檢出一株占4.55%（1/22）。產(chǎn)ESBLs的細菌呈世界性分布，但由于不同地區(qū)藥物使用不同等原因，其流行基因型也不盡相同。文獻報道在北美地區(qū)流行的主要基因型是TEM和SHV型[4]。日本主要是Toho-2組和CTX-M型酶。我國寧夏、廣州等地大腸埃希菌ESBLs基因主要為SHV和TEM型[5]，也有主要為CTX-M型的報道[6]，我們的檢測結(jié)果顯示拉薩地區(qū)臨床大腸埃希菌ESBLs的主要流行型別為TEM和SHV型。另外，由于ESBLs基因種類眾多，在我們所檢測的22株菌株中TEM、SHV及CTX-M型別均為陰性的6株菌株可能為其他型別，具體的基因種類需進一步研究確定。

本研究所使用菌株數(shù)量相對較少，來源也僅局限于拉薩市的三家臨床醫(yī)院，故尚不能夠全面反映出拉薩地區(qū)臨床大腸埃希菌株產(chǎn)ESBLs情況，但該研究對拉薩地區(qū)臨床醫(yī)師合理使用抗生素，控制耐藥菌株的形成及蔓延仍具有一定的實踐意義。

參考文獻：

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[2]Shah A A， Hasan F， Ahmed S， et al. Characteristics， epidemiology and clinical importance of emerging strains of Gram negative bacilli producing extended spectrum beta-lactamase [J]. ResMicrobiol， 2004，155（6）：409-421.

[3]張永標(biāo)，張扣興，唐英春，等.產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶和ESBLs細菌的耐藥性及β-內(nèi)酰胺酶基因型研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志， 2004，24（7）：577-582.

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[5]肖慶忠，蘇丹虹，江潔華，等.廣州地區(qū)3500株革蘭陰性桿菌TEM和SHV產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因分型研究[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2005，28：1010-1014.

[6]杜軍，李敏，崔景榮，等.產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌耐藥性及基因型研究[J].中國抗生素雜志，2009，34（8）：512-515.

編輯/申磊