摘 要：目的：對浙貝母內(nèi)生真菌以及抑菌活性菌株性質(zhì)進行分析探討，為今后的研究工作提供可靠的理論依據(jù)。方法：采取組織分離印跡對照法自浙貝母植株中分離內(nèi)生真菌，經(jīng)牛津杯法對抑菌活性進行篩選，對活性菌株展開發(fā)酵培養(yǎng)，并繪制出抑菌活性變化曲線、培養(yǎng)基消耗曲線以及次生代謝產(chǎn)物濃度變化曲線，經(jīng)高效發(fā)酵體系對抑菌活性菌株進行發(fā)酵，分離濃縮發(fā)酵液后，進行萃取分離。結(jié)果：經(jīng)統(tǒng)計試驗中共獲得36種內(nèi)生真菌，低下鱗莖中分離的BJ7具有很高的抑菌活性；發(fā)酵9天時的BJ7抑菌活性最佳。結(jié)論：浙貝母中可分離得到多種內(nèi)生真菌，其中以BJ7的抑菌活性最高，應(yīng)對其給予重視。

關(guān)鍵詞：浙貝母；內(nèi)生真菌；抑菌活性；菌株性質(zhì)；分離純化

本次研究中出于對浙貝母內(nèi)生真菌以及抑菌活性菌株性質(zhì)進行分析探討的目的，采取多種分離、純化、培養(yǎng)手段對浙貝母中內(nèi)生真菌以及抑菌活性菌株進行了分離研究，現(xiàn)匯報結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗藥物：寧波鄞州所產(chǎn)浙貝母，在花期采集地上和低下兩部分，清洗干凈后保存在4℃的環(huán)境中。

培養(yǎng)基：浙貝母內(nèi)生真菌分離與純化的培養(yǎng)基選擇PDA培養(yǎng)基[1]，組成包括：土豆?jié)舛葹?00g/l，葡萄糖濃度為20g/l，瓊脂濃度為20g/l；采取LB培養(yǎng)基作為細菌類的指示菌[2]，組成包括：酵母提取物5g/l，蛋白胨10g/l，氯化鈉5g/l，pH7.4；真菌發(fā)酵采取查氏優(yōu)化液培養(yǎng)基[3]，組成包括：蛋白胨0.5%，KCL0.05%，葡萄糖8%，K2HPO40.1%，MgSO40.15%，pH6.5。

指示菌：試驗中指示菌選擇金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離純化

取新鮮、無蟲害的浙貝母，分葉、莖、地下鱗莖等三個組成部分，采用濃度為75%的酒精浸泡1min左右之后，經(jīng)無菌水進行反復(fù)沖洗，沖洗次數(shù)控制在3-4次之間，在采用濃度為0.1%的升汞中浸泡5min左右，再采用無菌水進行反復(fù)沖洗，沖洗次數(shù)控制3-4次之間，經(jīng)解剖刀將外植體切塊，大小控制在5mm×5mm，接種到PDA培養(yǎng)基中，防止在28℃的培養(yǎng)箱中，并保證避光培養(yǎng)3-5天，然后待邊緣長出菌絲，挑取邊緣生長狀況良好的單一菌絲，接種在新配置PDA培養(yǎng)基中，長成菌落后再挑取邊緣菌絲培養(yǎng)，如此反復(fù)進行菌株純化處理，觀察菌落的具體生長情況。分離純化操作結(jié)束之后，重復(fù)進行上述實驗操作，采取同樣的方法實施再次的分離純化處理，最后將分離后得到的真菌與第一次分離處理后得到的真菌進行對比觀察，對真菌的內(nèi)生以及來源進行確定，實驗過程中應(yīng)該設(shè)置空白平板作為對照觀察。

1.2.2 抑菌活性的測定

將研究所需要的菌株接種到新鮮PDA平板上，在28℃的條件下進行培養(yǎng)一個星期左右，當真菌已經(jīng)長滿整個平板的時候，可以經(jīng)試管口在平板上壓出一個大小一致的PDA培養(yǎng)基圓餅，取出后放置在涂有三種細菌液的LB培養(yǎng)基，在28℃的條件下進行培養(yǎng)一天的時間，仔細觀察對圓餅周圍是否有抑菌圈出現(xiàn)，將無菌培養(yǎng)基作為空白對照觀察。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)生真菌的菌落特征

新鮮浙貝母經(jīng)分離處理后得到36種真菌，葉中分離處理后得到14種真菌，占38.89%，自莖中分離得到9種，占25.00%，地下鱗莖中分離處理后得到13種真菌，占36.11%。

2.2 活性菌株的篩選與鑒定

低下鱗莖分離處理后得到BJ菌株，對臨床上常見的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌均具有非常明顯的抑菌作用。菌株正面呈絨毛狀，黃綠色，邊緣呈纖毛狀，培養(yǎng)基腹面能夠觀察到棕黃色菌株，鏡下孢子梗呈長鏈狀，有特有形態(tài)。將內(nèi)生真菌菌絲提取的基因組作為模板，經(jīng)進行PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物實施電泳，PCR擴增產(chǎn)物表現(xiàn)單一明亮，片段在750bp左右，與預(yù)期的大小基本一致，試驗中將基因序列與NCBI基因庫進行了對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列與曲霉屬Aspergillus sp.的相似度為100%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征分析證實活性菌株為Aspergillus sp.BJ7。

2.3 Aspergillus sp.BJ7性質(zhì)初步研究結(jié)果

經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液自滴5天開始出現(xiàn)明顯的抑菌效果，在第9天時得到峰值，培養(yǎng)基在2-7天時開始快速降低，在第8-12天時保持平穩(wěn)，證實Aspergillus sp.BJ7在第8天后基本停止生長繁殖。通過觀察組第1-12天的發(fā)酵液吸光值發(fā)現(xiàn)，Aspergillus sp.BJ7的次生代謝產(chǎn)物濃度在第5天時達到峰值，在第8-9天時達到最低值，且保持平穩(wěn)，發(fā)酵液在60被稀釋后失去了抑菌活性，由此可推斷，Aspergillus sp.BJ7在第2-7天之間屬于快速生長期，從第8天開始會有次生代謝產(chǎn)物大量出現(xiàn)，抑菌效果從第10天開始呈現(xiàn)逐漸的降低的發(fā)展趨勢。

3 討論

臨床上應(yīng)用的中藥材浙貝母為百合科貝母屬多年生草本植物的一種，生物堿是其主要有效成分，貝母素甲和貝母素乙是最為常見的兩種，屬于異甾體生物堿類物質(zhì)的一種。浙貝母的主要功效作用為止咳、清熱化痰、開郁散結(jié)，臨床主要應(yīng)用該藥物對上呼吸道感染、胃十二指腸潰瘍、咽喉腫痛、支氣管炎、甲狀腺腫大、肺熱咳嗽、乳腺炎等疾病進行治療，效果非常理想[4]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，浙貝母中可分離多種內(nèi)生真菌[5]。由本次試驗可以發(fā)現(xiàn)，真菌在浙貝母植株中的分布以葉和地下鱗莖為主，其次為莖中。試驗中觀察到，發(fā)酵液抑菌活性從第9天開始呈現(xiàn)不斷降低的趨勢，主要由于抑菌活性物質(zhì)屬于堿性類物質(zhì)，Aspergillus sp.BJ7在生長后期會有酸性物質(zhì)大量分泌，兩者發(fā)生中和反應(yīng)，或?qū)σ志钚晕镔|(zhì)造成嚴重的破壞，也可能是抑菌活性物質(zhì)在Aspergillus sp.BJ7生長后期被分解利用，進而引起發(fā)酵抑菌活性逐漸降低[6]。

綜上所述，浙貝母中內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物可以對革蘭陽性菌、格蘭陰性菌產(chǎn)生較為普遍的抑菌作用，證實浙貝母中內(nèi)生真菌存在廣泛的抑菌活性物質(zhì)，經(jīng)分離純化與鑒定發(fā)現(xiàn)，其主要抑菌活性菌株為Aspergillus sp.BJ7，值得人們對其給予足夠的重視。

參考文獻

[1]田峰，何仁發(fā)，李明月，等.浙貝母內(nèi)生真菌菌珠FTJZZJ09及其抑菌活性成分[J].微生物學(xué)通報，2010，37（10）：93.

[2]葉波平，張少華，劉冰，等.浙貝母內(nèi)生真菌Nectria sp.JZ6分泌抑菌活性代謝產(chǎn)物的初步研究[J].菌物學(xué)報，2009，28（04）：603.

[3]顏霞，李希堯，李偉國.喜樹內(nèi)生真菌的分離及其代謝產(chǎn)物的初步研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，17（03）：315.

[4]董慶霖，陳博，邢向英，等.一株藍藻內(nèi)生真菌的鑒定及其產(chǎn)物抑菌活性[J].化工學(xué)報，2011，14（06）：1023-1024.

[5]祝興偉，張少華，王治維，等.一株來自于伊犁貝母的內(nèi)生尖孢鐮孢菌Y1的抑菌活性初步研究[J].菌物學(xué)報，2009，15（03）：332-334.

[6]王艷紅，徐磊，楊信東，等.溫莪術(shù)內(nèi)生真菌的分離及其抗菌活性的初步研究[J].中國藥學(xué)雜志，2009，16（13）：213-215.

作者簡介：陳弘毅（1984，8-），男，籍貫：浙江上虞，研究方向：藥物菌體篩選發(fā)酵提取及研制研究。