摘 要：采用Baird-Parker平板涂布法、Baird-Parker傾注法及Petrifilm測試紙片法，對含一定濃度的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)，并對食品中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果表明，三種方法的檢測結(jié)果有較好的一致性，且傾注法和紙片法操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定、再現(xiàn)性好；此外，紙片法在檢測簡便性、準(zhǔn)確性和檢測時(shí)間等方面的比較中優(yōu)于傾注法，綜合多方面因素考慮，紙片法在相關(guān)行業(yè)的日常檢測中值得推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；涂布法；傾注法；紙片法

中圖分類號： TB 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：16723198（2014）17019702

0 引言

隨著人們?nèi)找嬖鲩L的生活需求，食品質(zhì)量和安全問題備受大家關(guān)注。而金黃色葡萄球菌作為一種引起人類和動物化膿感染的重要致病菌和造成人類食物中毒的常見致病菌，已被列為我國食品衛(wèi)生微生物常規(guī)檢測項(xiàng)目之一。食品中金黃色葡萄球菌的定量檢測方法多采用Baird-Parker法，其作為檢測金黃色葡萄球菌的傳統(tǒng)方法已使用多年，且廣為大家所接受，但其操作較繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力。近年來，為了縮短檢測時(shí)間、簡化檢測程序，國內(nèi)外很多機(jī)構(gòu)研究了一些新的方法，美國3M公司研制的紙片法就是其中一種被諸多國際權(quán)威組織認(rèn)證的標(biāo)準(zhǔn)化測試方法。此外，還可利用平板傾注法與鑒別培養(yǎng)基Baird-Parke培養(yǎng)基結(jié)合的方法，對金黃色葡萄球菌活菌進(jìn)行快速檢測。本實(shí)驗(yàn)對Baird-Parker平板涂布法、Baird-Parker傾注法及Petrifilm測試紙片法檢測金黃色葡萄球菌進(jìn)行比較，旨在探求一種適應(yīng)微生物實(shí)驗(yàn)室要求的快速檢測方法，為今后的食品快速檢測方法的研究及應(yīng)用積累經(jīng)驗(yàn)。

1 料與方法

1.1 材料與儀器

樣品：熟肉制品、水產(chǎn)品、糕點(diǎn)采集自本市若干市場和超市，各10種。

菌株：金黃色葡萄球菌ATCC25923購置于北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司。

儀器：Hfsafe-1500TE型生物安全柜，上海力申科學(xué)儀器有限公司；LABPower-I型紅外接種環(huán)滅菌器，廣州海太光電生物科技有限公司；WX-80A型旋渦混合器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；DNP-9172型電熱恒溫培養(yǎng)箱；XSP-2CA型光學(xué)顯微鏡，上海光學(xué)儀器五廠；LC10063038型拍擊式均質(zhì)器，iMiX公司。

試劑：7.5%氯化鈉肉湯、Baird-Parke瓊脂培養(yǎng)基及配套試劑（亞碲酸鉀卵黃液）、腦心浸出液肉湯（BHI）、凍干兔血漿，由北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司生產(chǎn)；Petrifilm金黃色葡萄球菌快速檢驗(yàn)測試片，由美國3M公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌液的制備

將標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923接種于7.5%氯化鈉肉湯進(jìn)行增菌，36℃培養(yǎng)24h；將增菌液劃線接種于Baird-Parke瓊脂平板上，36℃培養(yǎng)45h-48h；挑取1-2個(gè)菌落用滅菌生理鹽水制成菌濃大約為1.0×108CFU/mL的菌懸液。

1.2.2 培養(yǎng)基準(zhǔn)備

將Baird-Parke瓊脂培養(yǎng)基按說明進(jìn)行配制，滅菌，制作成平板。同時(shí)部分培養(yǎng)基42℃水浴備用。

1.2.3 Baird-Parker平板涂布法

Baird-Parker平板涂布法按GB 4789.10-2010中第二法進(jìn)行。

1.2.4 Baird-Parker傾注法

無菌條件下，制備10倍系列稀釋樣品勻液，選擇2個(gè)至3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，每個(gè)稀釋度分別吸取1mL于培養(yǎng)皿中央，然后再加入Baird-Parker培養(yǎng)基，快速混勻，培養(yǎng)基凝固后，倒置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)；36℃士1℃培養(yǎng)45h-48h，觀察結(jié)果。典型菌落形態(tài)及鑒定參照GB 4789.10-2010。

1.2.5 Petrifilm測試紙片法

選擇2個(gè)至3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，每個(gè)稀釋度接種兩張測試片。將測試片置于平坦的實(shí)驗(yàn)臺面上，揭開上層膜，吸取1mL樣液滴于紙片的中央，將上層膜緩慢蓋下，避免氣泡產(chǎn)生，將壓板放置在上層膜中央處，輕輕摁壓使樣液均勻覆蓋于圓形的培養(yǎng)面積上，拿起壓板，靜置至少1min使培養(yǎng)基凝固。將測試片的透明面朝上置于培養(yǎng)箱內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。若測試片上無菌落或均為暗紫紅色菌落，則測試結(jié)束；若測試片上出現(xiàn)除典型紫紅色以外顏色的菌落，如黑色、藍(lán)綠色等，則需使用確認(rèn)片作進(jìn)一步確認(rèn)。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)方法

（1）分別用以上三種方法對標(biāo)準(zhǔn)菌液濃度重復(fù)性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

（2）分別用以上三種方法對食品中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 三種方法對金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)

三種方法對金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)結(jié)果如表1所示。

表1 不同方法測得的金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)

結(jié)果比較（×106CFU/mL）

利用t檢驗(yàn)法對三種方法測定結(jié)果兩兩比較分析，結(jié)果如下：

tAB=dABsdAB n=34/101299-352/1010-1/10 =0.968

tAC=dACsdACn=63/101493-632/1010-1/10 =1.805

tBC=dBCsdBCn=28/10466-282/1010-1/10=1.349

從t值表查得t0.05=2.262，故tABt0.05，PAC>0.05，PBC>t0.05，說明涂布法、傾注法和紙片法測得的結(jié)果無顯著差異，三種方法測得的結(jié)果比較接近；而涂布法的離散度為10.8，傾注法的離散度為5.5，紙片法的離散度為3.8，說明紙片法測得的結(jié)果精密度、再現(xiàn)性最好，傾注法次之，涂布法最差。

2.2 食品中金黃色葡萄球菌檢出結(jié)果比較，如表2所示。

表2 三種檢測方法的金黃色葡萄球菌檢出結(jié)果

由表2可知，紙片法的檢出率最高，為50%；涂布法和傾注法的檢出率比紙片法低，均為30%。而不同類別的產(chǎn)品檢出率也有所不同，被檢測樣品中水產(chǎn)品的檢出率最高，涂布法、傾注法和紙片法的檢出率分別為20%、20%和30%；熟肉制品的檢出率次之，分別為10%、10%和20%；糕點(diǎn)中金黃色葡萄球菌均未檢出，檢出率為0。究其原因，可能與產(chǎn)品的生產(chǎn)加工、包裝運(yùn)輸及銷售環(huán)境等因素有關(guān)。

2.3 三種方法檢測金黃色葡萄球菌的各項(xiàng)指標(biāo)比較

三種方法檢測金黃色葡萄球菌的各項(xiàng)指標(biāo)比較如表3所示。

表3 三種方法檢測金黃色葡萄球菌的各項(xiàng)指標(biāo)比較

注：*表示程度。

由表3可知，對于簡便性和工作量，涂布法和傾注法都包括培養(yǎng)48h后對典型菌落做兔血漿凝固酶的實(shí)驗(yàn)，操作相當(dāng)繁瑣，同時(shí)也加大了工作量；而紙片法由于其培養(yǎng)基系統(tǒng)是預(yù)先制備好的，省去了大量繁瑣的準(zhǔn)備工作，且紙片法對疑似菌落的確認(rèn)只需加確認(rèn)反應(yīng)培養(yǎng)1h-3h即可得出結(jié)果，與其他兩種方法相比工作量最少，操作使用最方便。對于檢測時(shí)間，涂布法和傾注法從接種培養(yǎng)到典型菌落的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)耗時(shí)78h；而紙片法從接種培養(yǎng)到對可疑菌落的確認(rèn)培養(yǎng)只需27h左右，大大地減少了檢測時(shí)間。對于計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性，涂布法和傾注法受人員操作熟練程度影響較大；而紙片法的操作更為標(biāo)準(zhǔn)化，人為誤差較小。對于檢測成本，涂布法和傾注法的成本相當(dāng)，而紙片法的成本則要高出許多。

3 結(jié)論

采用Baird-Parker平板涂布法、Baird-Parker傾注法及Petrifilm測試紙片法對含一定濃度的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果表明，三種方法測得的結(jié)果無明顯差異，具有較好的一致性；而且紙片法測得的結(jié)果穩(wěn)定、再現(xiàn)性最好，傾注法次之，涂布法最差。通過對食品中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢驗(yàn)，可知紙片法的檢出率最高，涂布法和傾注法的檢出率比紙片法低。此外，對這三種方法的其他指標(biāo)進(jìn)行比較，可知紙片法在簡便性、工作量、檢測時(shí)間、計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性等方面都優(yōu)于其他兩種方法，但是由于所用的測試紙片是進(jìn)口的，使得紙片法的成本比其他兩種方法高出許多，從而在某種程度上制約了其應(yīng)用。

雖然紙片法的成本高，但是金黃色葡萄球菌的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的Baird-Parker平板涂布法無顯著差異，且大大縮短了檢測時(shí)間；操作簡便，大大降低了傳統(tǒng)檢測方法的操作繁瑣性及實(shí)驗(yàn)時(shí)的工作量。所以紙片法在金黃色葡萄球菌定量檢測中具有優(yōu)勢，可作為食品中金黃色葡萄球菌快速檢測的方法，建議其在檢測部門、工廠企業(yè)等相關(guān)行業(yè)得到廣泛的應(yīng)用。

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