摘要：目的 探討胃平滑肌細(xì)胞G蛋白在胃輕癱發(fā)病機(jī)制中的作用以及中藥消痞方的防治效果。方法 健康雄性SD大鼠50只隨機(jī)分為五組，每組10只，分別為正常對(duì)照組、模型組、低劑量治療組、中劑量治療組和高劑量治療組。四氧嘧啶50 mg/Kg靜脈注射1次，建立大鼠糖尿病模型， 大鼠給藥量按臨床成人的劑量，通過(guò)體重系數(shù)折算成高、中、低劑量，正常對(duì)照組和糖尿病模型組給予相應(yīng)劑量的生理鹽水。營(yíng)養(yǎng)性半固體米糊法測(cè)定胃排空率，放射免疫方法測(cè)定胃平滑肌細(xì)胞cAMP含量。核酸原位雜交方法和計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對(duì)平滑肌細(xì)胞的Gsα、GiαmRNA的表達(dá)進(jìn)行定量分析。結(jié)果 ①胃排空率：模型組及低劑量組較中、高劑量組和正常組明顯減（P<0.05）。②胃平滑肌cAMP含量： 模型組及低劑量組較中、高劑量組和正常組明顯增高（P<0.05）。③Gsα、Giα的基因表達(dá)量：GsαmRNA陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色顆粒，位于平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)，模型組及低劑量組的表達(dá)量明顯高于中、高劑量組和正常組（P<0.05）；Giα mRNA陽(yáng)性物質(zhì)呈亮紅色顆粒，位于胞漿內(nèi)，各組之間的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 消痞方通過(guò)調(diào)節(jié)胃平滑肌的Gsα-mRNA的表達(dá)量及cAMP的含量維持在接近正常水平，對(duì)于糖尿病胃運(yùn)動(dòng)功能具有保護(hù)和改善作用。

關(guān)鍵詞：糖尿?。晃讣≥p癱；胃排空

中圖分類(lèi)號(hào)：R587.1

胃輕癱是糖尿病的常見(jiàn)合并癥，包括上腹部飽脹、惡心、嘔吐等癥狀[1]， Kassander在1958年首先提出糖尿病胃輕癱的概念[2]。關(guān)于其發(fā)病機(jī)制沒(méi)有完全清楚，目前認(rèn)為可能和以下因素有關(guān)：神經(jīng)病變、高血糖、胃腸激素及ICC細(xì)胞異常等[3]，有關(guān)胃平滑肌細(xì)胞G蛋白表達(dá)在其發(fā)病機(jī)制中的作用，以及中藥的影響目前國(guó)內(nèi)外罕有報(bào)道。因此，本文試圖探討胃平滑肌細(xì)胞G蛋白在其發(fā)病機(jī)制中的作用以及中藥消痞方的防治效果。

1資料與方法

1.1動(dòng)物與分組 健康清潔級(jí)成年雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量250～270 g，購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。隨機(jī)分為5組（每組10只）：正常對(duì)照組、模型組、低劑量治療組、中劑量治療組和高劑量治療組。

1.2模型制備及標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)大鼠先穩(wěn)定3 d，然后給予禁食12 h，尾靜脈注射四氧嘧啶50 mg/Kg/次，1 w后測(cè)定血糖濃度≥16.7 mmol/L，同時(shí)尿糖在（3+）以上確定為糖尿病模型。正常對(duì)照組給予等劑量生理鹽水注射，余處理同前。實(shí)驗(yàn)大鼠分籠飼養(yǎng)12 w，每周監(jiān)測(cè)體重、尿糖、24 h進(jìn)食量，飲水量、尿量。處死動(dòng)物后剖腹迅速沿胃大彎剪開(kāi)胃腔，在裝有Kreb液的燒杯內(nèi)仔細(xì)去除胃內(nèi)容物。剪取胃竇全層1塊1 cm×1 cm組織平鋪于濾紙上置于10%的福爾馬林緩沖液中固定、包埋、切片。

1.3實(shí)驗(yàn)用藥 消痞方由白術(shù)、枳實(shí)、黨參、炒萊菔子等組成，按比例稱(chēng)取，水煎、過(guò)濾，濃縮為3 g/mL。大鼠給藥量按臨床成人的劑量，通過(guò)體重系數(shù)折算成高、中、低劑量，分別為20 g/Kg/d， 10 g/Kg/d和5 g/Kg/d，按1 mL/Kg體積灌胃給藥，正常對(duì)照組和糖尿病模型組給予相應(yīng)劑量的生理鹽水。自造模成功第1 d開(kāi)始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，1次/d。

1.4實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)定

1.4.1胃排空率測(cè)定 參考文獻(xiàn)方法[4]胃排空率以（1-胃內(nèi)容物殘留率）表示。實(shí)驗(yàn)大鼠禁食不禁水12 h后，給予營(yíng)養(yǎng)性半固體米糊灌胃，用量為1 mL/100 g，灌胃30 min后脫頸處死大鼠，剖取全部胃腸，自幽門(mén)切跡處取胃，拭干稱(chēng)重，沿胃大彎剪開(kāi)胃體，洗去胃內(nèi)容物后拭干稱(chēng)凈重，計(jì)算胃內(nèi)容物殘留率=[（全胃重-胃凈重）/半固體米糊重]×100%。

1.4.2胃平滑肌cAMP含量測(cè)定 取胃竇組織1塊，撕去粘膜和漿膜層，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行組織勻漿。采用放免法測(cè)定，具體步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行（I125-cAMP放免試劑盒購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)）。

1.4.3胃平滑肌細(xì)胞Gsα、GiαmRNA的原位雜交 同上經(jīng)石蠟包埋，行5 μm的連續(xù)切片，置于Poly-L-Lysine處理過(guò)的專(zhuān)用載玻片上。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水化；3% H2O2室溫孵育10 min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；滴加消化液室溫孵育15 min，以暴露mRNA片斷；滴加預(yù)雜交液37℃濕盒孵育2 h；0.2×SSC洗3次，5 min/次；滴加雜交液37℃濕盒孵育4 h；梯度SSC洗滌；滴加封閉液，室溫孵育；滴加高敏鏈酶親和素過(guò)氧化物酶復(fù)合物（SABC） 37℃濕盒孵育40 min；PBS沖洗3次，3 min/次；DAB避光顯色5 min，水洗中止反應(yīng)；Giα指標(biāo)采用AEC顯色；復(fù)染，脫水，封片。實(shí)驗(yàn)設(shè)β-actin 為陽(yáng)性對(duì)照，正義探針為探針對(duì)照，無(wú)探針雜交液為陰性對(duì)照。首先在Olympus光學(xué)顯微鏡下初步觀察，以胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒（Gsα），亮紅色顆粒（Giα）為陽(yáng)性標(biāo)志，進(jìn)一步采用Olympus-BX51計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)采集圖像進(jìn)行半定量分析，每張切片在高倍鏡下觀察5個(gè)視野，測(cè)定平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)陽(yáng)性物質(zhì)的光密度，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。原位雜交試劑盒購(gòu)自天津?yàn)笊锛夹g(shù)有限責(zé)任公司。探針序列：Gsα 5'AggTT gTTTT TgATg TCCTg CACTT TggT 3'Giα 5'TggCT CTAAT gATgg CAATg ATggA CTggA 3'

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以（x±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組血糖、胃排空率和胃平滑肌cAMP含量結(jié)果，見(jiàn)表1。

2.1.1胃排空率 模型組較正常組明顯減低（P<0.05）；中、高劑量組和正常組無(wú)明顯差異（P>0.05），但較模型組明顯增高（P<0.05）；低劑量組與模型組比較無(wú)顯著差異（P>0.05），均顯著低于正常組和中、高劑量組（P<0.05）。

2.1.2胃平滑肌 cAMP含量 模型組較正常組明顯增高（P<0.05）；中、高劑量組和正常組無(wú)明顯差異（P>0.05），但較模型組明顯為低（P<0.05）；低劑量組與模型組比較無(wú)顯著差異（P>0.05），但均顯著高于正常組和中、高劑量組（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2胃平滑肌Gsα、GiαmRNA定位表達(dá)及定量分析

2.2.1胃平滑肌細(xì)胞GsαmRNA的定位表達(dá)及定量分析 在各組中胃竇平滑肌細(xì)胞的GsαmRNA的表達(dá)率為100%，陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色顆粒，位于胞漿內(nèi)。各組間比較結(jié)果顯示：中、高劑量組和正常組均顯著低于模型組（P<0.05），但其三組之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）；低劑量組與模型組比較無(wú)顯著差異（P>0.05），但均顯著高于正常組和中、高劑量組（P<0.05）。

2.2.2胃平滑肌GiαmRNA的定位表達(dá)及定量分析 在各組中胃竇平滑肌GiαmRNA的表達(dá)率為100%，陽(yáng)性物質(zhì)呈亮紅色顆粒，位于胞漿內(nèi)。各組間比較結(jié)果顯示：模型組、正常組、低、中、高劑量組，各組之間無(wú)顯著性差異（P>0.05），見(jiàn)表2。

3討論

糖尿病胃輕癱目前認(rèn)為起發(fā)病機(jī)制包括神經(jīng)病變、高血糖、胃腸激素及ICC細(xì)胞異常等因素，但是其核心問(wèn)題是胃動(dòng)力障礙。本文采用半固體米糊法測(cè)定胃排空率，結(jié)果為大鼠糖尿病模型組胃排空率明顯低于正常對(duì)照組，證實(shí)了糖尿病模型大鼠胃排空功能下降，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，同時(shí)也提示胃輕癱模型成立。

胃腸平滑肌是胃腸運(yùn)動(dòng)的具體執(zhí)行者。它的活動(dòng)受到神經(jīng)、激素和旁分泌機(jī)制等的調(diào)節(jié)[5]。神經(jīng)遞質(zhì)是通過(guò)與平滑肌細(xì)胞膜上的G 蛋白藕聯(lián)受體相互作用而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的。G 蛋白藕聯(lián)受體與配體結(jié)合后，通過(guò)其GTP/GDP結(jié)合狀態(tài)的轉(zhuǎn)化，在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起信號(hào)轉(zhuǎn)換器的作用。其被激活后，調(diào)節(jié)作為效應(yīng)器的酶或離子通道的活性，通過(guò)影響離子通道的開(kāi)放或產(chǎn)生的第二信使激活信使依賴(lài)的蛋白激酶，從而產(chǎn)生生物效應(yīng)。G蛋白分為4種亞型：Gsα， Giα， Gq/11α和G12/13α。其中Gsα對(duì)效應(yīng)蛋白起激活作用，Giα對(duì)效應(yīng)蛋白起抑制作用。肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高是平滑肌收縮的關(guān)鍵和基礎(chǔ)，而介導(dǎo)平滑肌舒張的胞內(nèi)第二信使主要是cAMP[6]。

腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC）是位于細(xì)胞膜上的G蛋白的效應(yīng)蛋白。AC催化ATP分解形成cAMP作為第二信使而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。AC的活性主要靠Gsα，Giα的調(diào)節(jié)，Gsα活化后對(duì)AC的活性起到激活作用促進(jìn)cAMP的生成；當(dāng)Giα活化后對(duì)AC的活性起到抑制作用繼而減少cAMP的生成。本實(shí)驗(yàn)：①通過(guò)放射免疫的方法檢測(cè)胃平滑肌細(xì)胞cAMP 的含量，結(jié)果顯示為糖尿病模型組較正常對(duì)照組含量明顯增多；②通過(guò)核酸原位雜交的方法檢測(cè)胃平滑肌Gsα，Giα-mRNA的表達(dá)，并進(jìn)行半定量分析，Gsα-mRNA結(jié)果顯示為糖尿病模型組較正常對(duì)照組含量明顯增多、Giα-mRNA結(jié)果顯示為實(shí)驗(yàn)的五組之間均無(wú)顯著性差異。以上結(jié)果說(shuō)明糖尿病模型大鼠胃平滑肌的Gsα-mRNA的表達(dá)量增多，Gsα含量增加，可能導(dǎo)致腺苷酸環(huán)化酶（AC）活性增加，進(jìn)一步引起cAMP含量增加，從而引起胃平滑肌收縮力減低，胃動(dòng)力障礙，胃排空率下降。

中醫(yī)藥是一個(gè)偉大的寶庫(kù)，在治療胃腸動(dòng)力性疾病方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。根據(jù)糖尿病胃輕癱的臨床表現(xiàn)，現(xiàn)代中醫(yī)將其歸為\"痞滿(mǎn)\"或\"胃痞\"的范疇。糖尿病胃輕癱的“痞滿(mǎn)”其病機(jī)與糖尿病的基本病機(jī)脾虛有著密切的聯(lián)系[7]，因此認(rèn)為其病機(jī)為脾虛氣滯，據(jù)此我們提出了健脾理氣的治則。消痞方由白術(shù)、黨參、 枳實(shí)、炒萊菔子組成，方以白術(shù)為君，健脾祛濕，助脾運(yùn)化；以枳實(shí)下氣化滯，消痞除滿(mǎn)，為臣。黨參，以助白術(shù)補(bǔ)脾養(yǎng)胃之功，增加炒萊菔子，消食除脹，助枳實(shí)以消痞除滿(mǎn)?，F(xiàn)代中藥研究也證實(shí)了白術(shù)、黨參、枳實(shí)、炒萊菔子等具有改善胃腸功能，促進(jìn)胃腸動(dòng)力的作用[8]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)放射免疫的方法檢測(cè)胃平滑肌細(xì)胞cAMP的含量，結(jié)果顯示為糖尿病模型組較正常對(duì)照組含量明顯增多、中高劑量組與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異、低劑量組與模型組無(wú)顯著性差異，但均高于正常組、中高劑量組；通過(guò)核酸原位雜交的方法檢測(cè)胃平滑肌Gsα，Giα-mRNA的表達(dá)，并進(jìn)行半定量分析，Gsα-mRNA結(jié)果顯示為糖尿病模型組較正常對(duì)照組含量明顯增多、中高劑量組與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異、低劑量組與模型組無(wú)顯著性差異，但均高于正常組、中高劑量組；Giα-mRNA結(jié)果顯示為實(shí)驗(yàn)的五組之間均無(wú)顯著性差異。

綜上所述，消痞方中高劑量組治療有效，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)胃平滑肌的Gsα-mRNA的表達(dá)量及cAMP的含量維持在接近正常水平，因此推測(cè)對(duì)于糖尿病胃運(yùn)動(dòng)功能具有保護(hù)和改善作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hasler WL. Gastroparesis[J].Curr Opin Gastroenterol，2012，28（6）：621-628.

[2]Kassander P. Asymptomatic gastric retention in diabetics[J].Ann Int Med，1958，48（4）：797-812.

[3]姚東英，劉菲.糖尿病胃輕癱發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].國(guó)際消化病雜志，2011，31（1）：16-18.

[4]段長(zhǎng)農(nóng)，程宜福.小鼠半固體米糊法加活性炭測(cè)定胃排空[J].皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，21（3）：184-185.

[5]朱玉賢，李毅.現(xiàn)代分子生物學(xué)[M].3版.北京：高等教育出版社，1997：315-326.

[6]周呂，柯美云.胃腸動(dòng)力學(xué)-基礎(chǔ)與臨床[M].北京：科學(xué)出版社，1999：212-226.

[7]尚瑩瑩，黃天生，肖定洪.糖尿病胃輕癱中醫(yī)理論及臨床研究進(jìn)展[J].中醫(yī)研究，2013，26（1）：75-77.

[8]張啟榮，李莉，陳德森，等.厚樸、枳實(shí)、大黃、陳皮對(duì)兔離體胃底平滑肌運(yùn)動(dòng)的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2008，15（7）：279-280.編輯/肖慧