摘要：目的 優(yōu)化靈芝多糖的制備工藝并評(píng)價(jià)其清除自由基能力。方法 使用熱水浸提法從靈芝中提取醛基化天然多糖，根據(jù)Fenton反應(yīng)原理對(duì)靈芝多糖清除自由基的能力進(jìn)行分析。結(jié)果 料液比為1︰25，在70℃下浸提2.5h，提得率達(dá)到最高值2.6%。靈芝多糖對(duì)·OH的 IC50 最高可達(dá)1.58 mg·ml-1，對(duì)·O-2的IC50達(dá)2.83 mg·mL-1。結(jié)論 優(yōu)化的最佳制備工藝為：料液比為1∶25，熱水浸提的時(shí)間為2.5h，提取的溫度在70℃左右。所制備的靈芝多糖具有良好的清除自由基能力。

關(guān)鍵詞：靈芝多糖；自由基；熱水浸提法

靈芝多糖具有提高機(jī)體免疫力、抑制腫瘤、延緩衰老等多種藥理活性[1]。近年來，國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)天然植物多糖修飾的聚陽離子作為基因藥物載體具有無毒、無免疫原性、可降解性等特點(diǎn)[2-3]。靈芝多糖的發(fā)現(xiàn)與藥理研究，為靈芝用作癌癥化學(xué)治療與放射治療的輔助劑提供了重要的理論依據(jù)。

自由基不僅是生體多種生理功能的啟動(dòng)因素和生化反應(yīng)的介導(dǎo)者，同時(shí)也在免疫細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中起調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，人類機(jī)體內(nèi)自由基隨著年齡的增長(zhǎng)其自穩(wěn)態(tài)平衡性下降，從而導(dǎo)致自身免疫功能下降，容易引發(fā)腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、原發(fā)性高血壓等自由基疾病[5]。有研究表明真菌提取物對(duì)自由基有一定的清除作用[6]。而多糖是真菌中的主要活性成分，因此多糖對(duì)自由基可能也具有一定的清除作用，但這些需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1靈芝多糖的制備 本研究采用熱水浸提法提取靈芝多糖，具體方法是：將破壁靈芝孢子粉與去離子水配制成不同料液比的懸液，在不同溫度下浸提一段時(shí)間；以Sevage試劑[氯仿：正丁醇=5∶1（V/V）]除蛋白6、7次，直至蛋白質(zhì)除盡。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃蒸餾濃縮，并用離心機(jī)取沉淀物（靈芝粉）。將靈芝粉配成重量比為5%的靈芝粉水溶液，在65℃～75℃攪拌下反應(yīng)4h。靜止沉降后取上層清液，再重復(fù)提取1～2次。將該濃縮液體放入95%乙醇中純化、干燥。將提取的靈芝多糖配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的水溶液加入高碘酸鈉，避光磁力攪拌下反應(yīng)24h，隨后加入乙二醇終止反應(yīng)15min，終止液加入NaCl，混勻5min，按體積比1：5倒入無水乙醇中沉淀、析出，將沉淀物干燥后得終產(chǎn)物醛基化靈芝多糖。

1.2性能測(cè)試

1.2.1對(duì)羥自由基（oOH）的清除作用 根據(jù)Fen-ton反應(yīng)原理， H2O2在Fe2+存在時(shí)生成·OH，反應(yīng)式如下：Fe2++ H2O2→Fe3++·OH +OH-?！H可使番紅花T褪色。反應(yīng)體系終體積4.5mL，其中含150mmol·L-1硫酸鈉鹽緩沖溶液（pH值7.4）、114 μmol·L-1番紅花T、1.927 mmol·L-1 EDTA·Na2、1.0 mmol·L-1 硫酸亞鐵、3% H2O2 以及不同濃度的樣品，在37℃恒溫水浴30min后，加入0.3mmol·L-1 EDTA·Na2終止反應(yīng)，以緩沖溶液作參比檢測(cè)其OD值。空白組以0.1mL蒸餾水替代樣品，對(duì)照組以1.5mL蒸餾水替代樣品和 EDTA·Na2。清除率=（A樣品-A空白）/A對(duì)照×100%。

1.2.3對(duì)超氧陰離子自由基（·O-2）的清除作用 鄰苯三酚在堿性條件下能發(fā)生自氧化生成有色中間物和·O-2，依據(jù)有色中間物的生成量可判斷·O-2的生成量。將0.1mL不同濃度的樣品，在25℃水浴20min后加入3mL濃度為7 mmol·L-1的鄰苯三酚，反應(yīng)4min后加入10mmol·L-1的HCl終止反應(yīng)，以Tris-HCl緩沖溶液作參比，在420nm處測(cè)OD值。對(duì)照組以0.1mL蒸餾水替代樣品，空白組為不加鄰苯三酚。按下式計(jì)算清除率：清除率=（A'樣品-A'空白）∕A'對(duì)照×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1熱水浸提法提取工藝的優(yōu)化 首先確定熱水浸提法的最適溫度。稱取2g靈芝孢子粉，分別于溫度在80℃，70℃和60℃浸提，料液比控制在1∶25，測(cè)試不同溫度下不同時(shí)間的浸出率，其結(jié)果如圖1所示。可以看出不同溫度下，提出的速率不同，但溫度過高會(huì)導(dǎo)致多糖的水解。因此，在80℃下隨著時(shí)間的推移吸光度和浸提率也沒有明顯的變化趨勢(shì)。而當(dāng)溫度為60℃、70℃時(shí)，隨著時(shí)間的變化吸光度和浸提率都明顯上升趨勢(shì)，比較兩個(gè)溫度，70℃下吸光度變化更明顯，因此70℃為更適宜溫度。從圖中還可看出，反應(yīng)時(shí)間超過2.5h時(shí)浸出率出現(xiàn)了下降或者維持不變，表明最佳浸提時(shí)間當(dāng)為2.5h左右。

料液比是熱水浸提法提取靈芝多糖的另一個(gè)重要參數(shù)。選配料液比分別為1∶15，1∶20，1∶25，1∶30的靈芝孢子懸液，在70℃下浸提，每30min測(cè)定多糖吸光度A490并計(jì)算浸出率。結(jié)果如圖2所示，料液比在1∶25的樣品浸提2.5h后，多糖浸出率最高，達(dá)到2.63 %，故最佳料液比應(yīng)選為1∶25。

1.2.2多糖清除自由基能力的評(píng)價(jià) 由表1可知，隨著靈芝多糖濃度的增加，對(duì)Fen-ton反應(yīng)體系產(chǎn)生的羥自由基·OH和鄰苯三酚自氧化體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基·O-2的清除率相應(yīng)增大。在相同濃度下，提取的靈芝多糖對(duì)·OH的清除效果明顯強(qiáng)于·O-2。對(duì)兩種自由基的清除值IC50分別高達(dá)1.58mg·mL-1和2.83mg·mL-1。樣品濃度和清除率基本呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，說明量效關(guān)系非常明顯。此外，靈芝多糖清除羥自由基·OH的能力強(qiáng)于超氧陰離子自由基·O-2。

3 結(jié)論

3.1控制料液比在1∶25，溫度70℃，保溫2.5h，有利于多糖浸提。

3.2對(duì)不同自由基的清除能力進(jìn)行比較，結(jié)果表明提取的靈芝多糖清除羥自由基·OH的能力和超氧陰離子自由基·O-2均較好，并且清除能力和多糖濃度存在明顯的正相關(guān)量效關(guān)系，相對(duì)而言，靈芝多糖清除羥自由基·OH的能力優(yōu)于清除超氧陰離子自由基·O-2的能力。

參考文獻(xiàn)：

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編輯/哈濤