【摘 要】 目的 探討膿毒血癥過程中心肌Caspase-3蛋白表達與心肌細胞凋亡的關(guān)系。方法 酵母多糖懸濁液建立膿毒血癥模型，檢測心肌細胞凋亡和Caspase-3蛋白表達。結(jié)果 第三天和第六天對照組大鼠心肌凋亡指數(shù)和Caspase-3蛋白明顯低于750mg/kg和1000mg/kg組，組內(nèi)比較顯示，各組大鼠第六天心肌凋亡指數(shù)較第三天明顯增加（P<0.05）。結(jié)論 酵母多糖懸濁液所致的膿毒血癥伴有凋亡蛋白的高表達，造成心肌細胞嚴重損害，應(yīng)注意心肌營養(yǎng)。

【關(guān)鍵詞】 膿毒血癥；Caspase-3蛋白；心肌細胞凋亡

【中圖分類號】 R631+.1 【文獻標識碼】 B

膿毒血癥與感染相關(guān)，發(fā)病率和病死率高。革蘭陰性菌感染引起的內(nèi)毒素釋放及腸源性內(nèi)毒素易位是導(dǎo)致膿毒癥的重要因素。內(nèi)毒素通過與單核巨噬細胞膜上的受體CDl4結(jié)合，進而與受體TLR4結(jié)合將信號轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，導(dǎo)致細胞活化、釋放各種炎癥介質(zhì)（如TNF-a、IL-1和IL-6等），出現(xiàn)心肌細胞凋亡，可以說心肌細胞的凋亡在膿毒血癥發(fā)生過程中起著一定的促進作用[1]。本文重點討論膿毒血癥過程中心肌Caspase-3蛋白表達與心肌細胞凋亡的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 小鼠抗大鼠Caspase-3單克隆抗體購自武漢博士的生物工程有限公司。細胞凋亡原位檢測試劑盒購自德國B.M公司。

1.2 動物模型的建立 將酵母多糖和液體石蠟混合，磁力攪拌器攪拌15min混勻制成懸濁液，100℃水浴80min滅菌，制成濃度為100mg/ml的酵母多糖-石蠟懸液（ZPS），冷卻后放入4℃冰箱備用，臨用前40℃水浴及高頻攪拌15min后注射。Wistar大鼠實驗前12h開始禁食不禁水，實驗前1-2h稱重并測肛溫。模型判斷標準：注射ZPS后較注射前肛溫升高或降低1℃、WBC增加1倍或減少50%、呼吸頻率超過正常值2倍或動脈血PaCO2較正常降低25%、心率較對照值增加50%。

1.3 實驗分組 Wistar大鼠隨機分為3組，每組12只：正常組、750mg/kg組、1000mg/kg組，連續(xù)3天，2次/天，各組末次注射后處死，留取心肌組織標本。

1.4 原位末端標記法檢測心肌細胞凋亡 取大鼠左心室心肌行冰凍切片，按照試劑盒說明書操作。每組（每只）觀察10張切片，光鏡下（×400）每張切片隨機取10個視野，應(yīng)用MICRO-COS-MOS MiVnt圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，測定陽性細胞胞核胞漿的平均光密度（MOD值）與陽性細胞百分比，計算細胞凋亡指數(shù)AI（AI%=MOD×陽性細胞百分比×100）。

1.5 心肌組織Caspase-3蛋白表達 將心肌組織置于10%甲醛固定液中，-80℃冰箱保存，免疫組化法S-P法測蛋白表達，棕黃色顆粒為陽性，用PBS代替一抗為陰性對照。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)處理，每高倍鏡下隨機觀察五個不重疊視野，分別測得每個視野的陽性表達灰度，求平均灰度，反應(yīng)細胞及間質(zhì)細胞Caspase-3蛋白表達。

1.6 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 心肌細胞凋亡指數(shù)比較 第三天和第六天對照組大鼠心肌凋亡指數(shù)明顯低于750mg/kg和1000mg/kg組（P=0.000），組內(nèi)比較顯示，各組大鼠第六天心肌凋亡指數(shù)較第三天明顯增加（P<0.05），見表1。

2.2 心肌組織Caspase-3蛋白表達 第三天和第六天對照組大鼠Caspase-3蛋白明顯高于750mg/kg和1000mg/kg組（P=0.000），組內(nèi)比較顯示，各組大鼠第六天Caspase-3蛋白較第三天明顯增加（P<0.05），見表2。

3 討論

心肌細胞的凋亡是由基因控制的細胞自主并且有序的死亡，涉及一系列的基因激活、表達和調(diào)控等，心肌細胞的凋亡可能會影響心肌的功能，進而影響機體的健康，一個細胞凋亡過程的內(nèi)在敏感性是由Caspase-3基因家族決定的。Caspase-3的過度表達能通過阻止細胞凋亡延長細胞生存率.這種情況包括由一系列信號物質(zhì)誘導(dǎo)的凋亡如紫外線、細胞因子、生長因子缺失以及熱休克等：不僅如此，有研究顯示Caspase-3蛋基因的過度表達提高了膿毒癥的生存率，而同時在因膿毒癥死亡的病人中發(fā)現(xiàn)外周血單核細胞其Caspase-3蛋基因表達下降，膿毒癥誘導(dǎo)的小腸凋亡增加，同時，顯示M相的細胞周期停滯，而Caspase-3蛋的過度表達則可以使小腸凋亡減少，部分逆轉(zhuǎn)膿毒癥的這種細胞周期效應(yīng)。

在膿毒癥中，Caspase-3蛋白水平降低，之后又反彈.使在膿毒癥最初的幾個小時之內(nèi)，Caspase-3蛋的過度表達有利于改善膿毒癥的預(yù)后，在決定細胞存亡中起關(guān)鍵作用[2]。實驗結(jié)果顯示，注射酵母多糖懸濁液后大鼠的心肌凋亡指數(shù)較對照組比較明顯增加，并且隨著時間的延長凋亡數(shù)量逐漸增加，說明膿毒血癥會對大鼠的心肌細胞造成損害，同時由于初期對機體的心肌細胞已經(jīng)造成了不可逆的損害致使后期未注射酵母多糖懸濁液的這段時間心肌細胞進一步凋亡，并沒有恢復(fù)的跡象，主要可能是由于心肌損傷造成心臟有效收縮下降，造成未刺激時不僅沒有恢復(fù)反而凋亡增加的原因。心肌Bax，Bcl-2，Caspase-3蛋白的表達在膿毒血癥組也表現(xiàn)明顯，主要是促凋亡基因Bax和Caspase-3表達顯著，促凋亡蛋白表達主要作用于線粒體膜，而抑制凋亡蛋白的表達主要是和促凋亡蛋白結(jié)合為二聚體之后發(fā)揮作用，由此可見促凋亡蛋白表達數(shù)量和抑制凋亡蛋白的表達數(shù)量均增加，且隨著時間的延長，蛋白的表達并未有下降的趨勢，因此說明心肌凋亡情況與Caspase-3蛋白表達變化一致，進一步說明膿毒血癥初期及中期心肌細胞凋亡與Caspase-3蛋白表達水平有關(guān)[3]?？赡軝C制如下：其一：系列研究顯示三氯生可以降低機體的進食量，而我們機體是由蛋白質(zhì)堆積而成等的，經(jīng)口攝入蛋白質(zhì)的缺失加上為了滿足機體能量需要組織的分解，導(dǎo)致組織器官缺血缺氧，而心肌組織作為對缺血缺氧較為敏感的器官，所以間接損傷心肌組織，造成凋亡蛋白表達增加；其二：膿毒血癥過程中，有毒有害的物質(zhì)直接到達心肌組織，影響心肌的有效收縮量，直接造成心肌細胞的損害，心肌凋亡蛋白表達增加。

總之，由酵母多糖懸濁液所致的膿毒血癥伴有凋亡蛋白的高表達，造成心肌細胞嚴重損害，因此對于膿毒血癥的患者臨床治療過程中要注意，給心肌足夠的營養(yǎng)，同時實用保護心肌細胞的相關(guān)藥物，避免造成心肌不可逆的損害。

參考文獻

[1] 伍方紅，許得澤，韋繼政，等.降鈣素原及C反應(yīng)蛋白檢測在術(shù)后重度膿毒血癥患者預(yù)后判斷中的意義[J].廣東醫(yī)學，2013，34（9）：1369-1371.

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[3] 王宇卉，邵福源，夏春林，等.大鼠大腦中動脈缺血/再灌注模型中Caspase-3的表達[J].臨床神經(jīng)病學雜志，2003，16（4）：214-217.