摘 要：豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDv）是冠狀病毒屬的成員之一，會(huì)引起哺乳仔豬急性發(fā)作嚴(yán)重的腹瀉和嘔吐，從而導(dǎo)致其大批死亡。PEDv最初發(fā)現(xiàn)于歐洲，現(xiàn)今已傳播到亞洲。其在美國的首次出現(xiàn)時(shí)間為2013年5月，并且至2013年7月中旬，15個(gè)州確定存在PEDv。因此，美國急需快速、高通量的診斷檢測方法，以進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測和監(jiān)視。我們旨在設(shè)計(jì)可供診斷室使用的PEDv的ELISA測定分析方法，以檢測豬血清、口液和糞便中PEDv抗體。研究人員已完成了美國多個(gè)PEDv分離株的病毒顆粒（N）和纖突蛋白（spike protein）1區(qū)（S1）和2區(qū)（S2）的測序，發(fā)現(xiàn)它們的同源性在99 %以上。因此，任意分離株的重組蛋白都可以代表美國的PEDv分離株，且在酶聯(lián)免疫吸附測定中應(yīng)該能產(chǎn)生交叉反應(yīng)。為了凈化PEDv蛋白，筆者設(shè)計(jì)了PCR引物，以擴(kuò)增N、S1和S2。隨后，擴(kuò)增的基因克隆到pET-25b和pMAL-p5X載體中，以進(jìn)行細(xì)菌表達(dá)。兩種載體將用于提高獲得大量高純度蛋白質(zhì)的可能性。6X-his標(biāo)簽用于金屬親合蛋白（pET-25b）的純化，而麥芽糖結(jié)合蛋白融合通過淀粉色譜分析法用于蛋白質(zhì)純化（pMAL-p5X）。純合蛋白一旦獲得，將要開發(fā)的直接ELISA法用于檢測豬血清中PEDv抗體。血清檢測中獲得最佳ELISA結(jié)果的蛋白或蛋白融合物將進(jìn)一步優(yōu)化，以用于糞便和口液樣本中病毒抗體的檢測。

關(guān)鍵詞：豬腹瀉；ELISA；血清學(xué)；檢測；監(jiān)視

中圖分類號(hào)：S855 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2014）01-0007-02

1 緒論

豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDv）是冠狀病毒屬的成員之一，會(huì)引起哺乳仔豬和生長豬急性爆發(fā)嚴(yán)重的腹瀉和嘔吐，并會(huì)引發(fā)乳豬大批死亡。1971年，PEDv在歐洲被首次發(fā)現(xiàn)，1982年成為亞洲的地方病。2013年5月，美國證實(shí)存在此病毒。由于病毒的出現(xiàn)，美國養(yǎng)豬業(yè)急需快速、高通量的診斷測試方法，以進(jìn)行病毒的血清學(xué)檢測和監(jiān)視。為了達(dá)到這一目標(biāo)，筆者設(shè)計(jì)PEDv的ELISA方法，以檢測豬血清中是否存在抗PEDv的抗體。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 PCR引物設(shè)計(jì)，以擴(kuò)增病毒粒子（N）和纖突蛋白1區(qū)（S1）和2區(qū)（S2）。

2.2 從受感染豬的糞便中提取PEDv核糖核酸（PEDv RNA），合成cDNA，并利用PCR進(jìn)行擴(kuò)增。

2.3 PCR產(chǎn)物克隆到兩個(gè)質(zhì)粒載體（pET-25b和pMAL-p5X）中。

2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大腸桿菌細(xì)胞中，以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。

2.5 表達(dá)的蛋白質(zhì)用6-his標(biāo)記進(jìn)行純化，并利用金屬親合色譜法（pET-25b），或麥芽糖結(jié)合蛋白融合法和淀粉親合色譜法（pMAL-p5x）進(jìn)行固定。

2.6 回收的蛋白經(jīng)純化和濃縮后，用凝膠電泳和分光光度技術(shù)進(jìn)行確認(rèn)。

2.7 純化蛋白質(zhì)用于開發(fā)直接競爭ELISA分析方法，以進(jìn)行抗PEDv抗體的檢測。

3 試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

⑴ 冠狀病毒的病毒顆粒和纖突蛋白質(zhì)具有高度免疫原性，早先用于篩選豬血清，以尋找接觸和前先感染冠狀病毒，包括PEDv的血清學(xué)證據(jù)（Knuchel等，1992）。

⑵ 我們已成功把S2基因克隆進(jìn)入載體pMAL-p5X中，蛋白質(zhì)表達(dá)正在進(jìn)行之中。

⑶ 目前，S1和N基因已能夠進(jìn)行克隆。

⑷ PEDv纖突蛋白S1區(qū)包括中和抗原表位。因此，我們預(yù)計(jì)此重組蛋白對(duì)評(píng)估中和和交叉中和活性非常有用。

⑸ ELISA的開發(fā)將加快美國豬群PEDv感染狀態(tài)的篩選和監(jiān)測，并預(yù)測有助于控制和殺滅PEDV 。原題名：Development and validation of ELISA testing for serological monitoring and surveillance of porcine epidemic diarrhea virus（英文）

原作者：B. Wier，C. M. T. Dvorak和M. P. Murtagugh（明尼蘇達(dá)大學(xué)獸醫(yī)和生物醫(yī)學(xué)系）