李春梅 林 娟

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福州 350108)

魚粉是肉食性魚類飼料中不可或缺的蛋白質(zhì)來源，2012年我國魚粉年產(chǎn)量約為120萬t，此后受漁業(yè)資源有限及環(huán)保趨緊影響，2018年降至40萬t[1]。為應(yīng)對魚粉供不應(yīng)求的市場局面和緩解魚粉價格波動的沖擊，降低飼料成本，尋找合適的魚粉替代品，開發(fā)低魚粉、無魚粉飼料已成為國內(nèi)外飼料界的一個重要課題。在植物蛋白質(zhì)源中，大豆具有來源廣泛、產(chǎn)量穩(wěn)定、蛋白質(zhì)含量高、氨基酸比例適宜等優(yōu)點(diǎn)，被視為替代魚粉的最有潛力的植物蛋白質(zhì)源。豆粕是大豆提取油脂后的副產(chǎn)物，是水產(chǎn)飼料中利用最為廣泛的植物蛋白質(zhì)源[2]，但其熱敏性的抗原蛋白和不良寡糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子成分含量高，飼喂后對動物健康造成一定損害。微生物發(fā)酵是克服豆粕替代魚粉在水產(chǎn)養(yǎng)殖中局限性的一種高效、經(jīng)濟(jì)和環(huán)保的方法。豆粕經(jīng)過微生物的發(fā)酵作用，難吸收的大分子蛋白質(zhì)、糖類降解為易消化吸收的小分子物質(zhì)，抗?fàn)I養(yǎng)因子成分有效去除，并且益生菌增殖可以抑制有害菌生長，改善動物腸道菌群結(jié)構(gòu)。大黃魚(Pseudosciaenacrocea)是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類，肉質(zhì)鮮美，經(jīng)濟(jì)價值大，0.57 g的大黃魚所需飼料蛋白質(zhì)水平在47%以上[3]。因此，以發(fā)酵豆粕替代大黃魚飼料中的部分魚粉具有重要意義。魚類飼料中發(fā)酵豆粕替代魚粉的研究多有報道，研究結(jié)論卻不盡相同。吳釗[4]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵豆粕替代20%的魚粉飼喂大黃魚時魚體各項(xiàng)指標(biāo)較佳；張艷秋[5]研究表明，相較于對照組的400 g/kg魚粉飼料，發(fā)酵豆粕可將花鱸飼料中的魚粉含量降至240 g/kg；Wang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌P8發(fā)酵豆粕替代大菱鲆45%的魚粉，其總抗氧化能力提高，生長性能與全魚粉組相當(dāng)；Rahimnejad等[7]研究顯示，用發(fā)酵豆粕替代40%的魚粉不會顯著影響魚體生長和過氧化氫酶活性，卻會導(dǎo)致前腸蛋白酶活性降低；Catalan等[8]研究表明，30%發(fā)酵豆粕替代魚粉對大西洋鮭生長及健康狀況有積極影響；Dong等[9]報道，采用枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸桿菌混菌兩步發(fā)酵的豆粕替代虹鱒飼料中40%的魚粉不會對虹鱒的生長和飼料利用率產(chǎn)生不利影響。本試驗(yàn)采用枯草芽孢桿菌與植物乳桿菌混菌兩步發(fā)酵技術(shù)，制備營養(yǎng)豐富、適口性好、活菌數(shù)高的發(fā)酵豆粕，并將其分別替代基礎(chǔ)飼料中30%和50%魚粉，探究其對大黃魚生長性能、消化性能和非特異性免疫功能的影響，為生物發(fā)酵飼料在大黃魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)酵菌種枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌均為本課題組保藏菌種；大黃魚由寧德某水產(chǎn)有限公司提供；豆粕和大黃魚配合飼料由福建某生物科技有限公司提供；試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

BS224S分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]、PHS-3C pH計(jì)[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]、YXQ-LS-50高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)、SW-CJ-2FD超凈工作臺(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、GNP-9080恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、ZWY-2101C恒溫?fù)u床(上海智城分析儀器制造有限公司)、CF16RX II高速冷凍離心機(jī)[日立(中國)有限公司]、MULTISKAN GO酶標(biāo)儀[賽默飛世爾(上海)儀器有限公司]、DHG-9240A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、AE-8150蛋白電泳儀(日本ATTO公司)、ZWY-110X50水浴搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)、FD-1-50真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、DS-11FX熒光分光光度計(jì)[美國丹諾爾(Denovix)公司]、TU-100C恒溫金屬浴(上海一恒科技有限公司)。

1.3 豆粕發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.3.1 發(fā)酵菌種的制備

1.3.1.1 植物乳桿菌種子液的制備

發(fā)酵培養(yǎng)基組成：無水葡萄糖2%，大豆蛋白胨4%，檸檬酸氫二銨0.3%，MnSO4·H2O 0.01%；培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基初始pH 7.0，裝液量100 mL/250 mL，接種量3%(v/v)，溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速50 r/min，培養(yǎng)14 h，活菌數(shù)達(dá)到109CFU/mL。

1.3.1.2 枯草芽孢桿菌種子液的制備

發(fā)酵培養(yǎng)基組成：麥芽糊精1.5%，大豆蛋白胨2%；培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基初始pH 7.0，裝液量40 mL/250 mL，接種量2%(v/v)，溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)20 h，活菌數(shù)達(dá)到109CFU/mL。

1.3.2 發(fā)酵參數(shù)設(shè)定

以小肽、游離氨基酸和乳酸含量為考察指標(biāo)，選擇發(fā)酵溫度(A)、枯草芽孢桿菌接種量(B)、枯草芽孢桿菌與植物乳桿菌接種比例(C)和發(fā)酵時間(D)進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 豆粕發(fā)酵正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experimental design of fermented soybean meal

1.4 發(fā)酵效果評價

1.4.1 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析蛋白質(zhì)降解情況

采用變性結(jié)合加熱的方法提取發(fā)酵豆粕中的蛋白質(zhì)。稱取1.00 g試樣，加入80 ℃預(yù)熱5 min的50 mL變性提取液[10]，攪拌提取30 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.4.2 小肽含量測定

試樣過80目篩，取1.00 g樣品加入6 mL 10%三氯乙酸[11]，160 r/min振蕩30 min，補(bǔ)加24 mL超純水，而后12 000 r/min離心3 min，取上清1 μL于熒光分光光度計(jì)測定小肽含量。

1.4.3 游離氨基酸含量測定

樣品處理同小肽含量測定，游離氨基酸含量測定參照李善仁[12]的方法。亮氨酸含量(y)與OD570(x)的關(guān)系式為：y=16.59x-0.1764(R2=0.990 2)。

1.4.4 枯草芽孢桿菌與植物乳桿菌活菌數(shù)計(jì)數(shù)

活菌計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，大豆蛋白胨40 g/L，檸檬酸氫二銨3 g/L，MnSO4·H2O 0.1 g/L，CaCO320 g/L，瓊脂 20 g/L，pH 7.0，115 ℃滅菌30 min。

稱取試樣1.00 g，加入10 mL無菌水，充分混勻，梯度稀釋后取10-7稀釋液100 μL涂布于固體培養(yǎng)基平板，設(shè)3個平行，37 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.4.5 乳酸含量測定

取0.5 g試樣，加入5 mL 80%乙醇超聲提取1 h，10 000 r/min離心3 min，取上清液按照梁瓊[13]的方法進(jìn)行乳酸含量測定，乳酸含量(y)與OD565(x)的關(guān)系式為：y=70.971x(R2=0.999 1)。

1.4.6 不良寡糖定性分析

在80%的乙醇溶液中分別加入0.01 g水蘇糖和棉子糖，溶解后4 ℃保存?zhèn)溆?。稱取發(fā)酵豆粕凍干粉5.0 g放入燒杯中，加入50.0 mL 80%的乙醇溶液，70 ℃水浴1 h，浸提液1 000 r/min離心10 min，取上清液4 ℃保存?zhèn)溆谩０凑仗K亮[14]的方法進(jìn)行薄層色譜(TLC)分析。

1.5 大黃魚養(yǎng)殖試驗(yàn)

1.5.1 發(fā)酵豆粕的制備

基質(zhì)含水量50%，以正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)工藝進(jìn)行發(fā)酵豆粕的制備，將其部分替代魚粉配制大黃魚飼料。

1.5.2 飼料配制

首先配制魚粉含量為25%的基礎(chǔ)飼料(FM，作為對照)，然后在基礎(chǔ)飼料配方基礎(chǔ)上配制試驗(yàn)飼料：以發(fā)酵豆粕分別替代30%(FSBM-30)和50%(FSBM-50)的魚粉，考慮到所有飼料成品的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪等營養(yǎng)成分含量應(yīng)保持一致，而采用發(fā)酵豆粕取代魚粉后粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量會降低，因此相應(yīng)地減少了試驗(yàn)組豆粕用量，增加了豆油用量。所用飼糧均含45%的粗蛋白質(zhì)和12%的粗脂肪，以保證大黃魚的最佳生長。大黃魚飼料組成見表2。

表2 大黃魚飼料組成Table 2 Composition of diets for large yellow croaker %

1.5.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

大黃魚從海中打撈上岸后快速隨機(jī)分裝到各桶，適應(yīng)期6 d后，將大黃魚共270尾投入正式試驗(yàn)。每種飼料投喂3桶，每桶30尾魚。各桶均采用增氧泵加充氣石24 h增氧，使水中溶解氧濃度保持在5.0 mg/L以上。試驗(yàn)初始測得大黃魚平均體長(11.07±1.71) cm，平均全長(13.26±1.80) cm，平均體重(22.81±9.16) g。正式養(yǎng)殖期為46 d，期間日投餌2次(09:00和17:00)，日投餌量為體重的2%，并根據(jù)采食情況進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，每天記錄攝食量和魚死亡情況。每天上午投餌前換水、清污，據(jù)魚體狀態(tài)不定期進(jìn)行消毒處理。

1.5.4 樣品采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，停喂24 h，從各桶分別隨機(jī)取樣，每桶取10尾，用丁香油水門汀麻醉劑對魚體進(jìn)行麻醉，稱量體重，測量體長和全長；之后用無菌采血器尾靜脈采血，置于1.5 mL離心管中4 ℃過夜，4 ℃、11 000 r/min離心10 min，取血清，用于生化指標(biāo)測定；取血完畢后解剖魚體，取肝臟和脾臟稱重，用于計(jì)算肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)；取胃腸道組織，用于消化酶活性測定。

1.5.5 指標(biāo)測定

1.5.5.1 生長性能

成活率(survival rate,SR,%)=(存活魚尾數(shù)/初始魚尾數(shù))×100；增重率(weight gain rate,WGR,%)=[(末重-初重)/初重]×100；體長增長率(body length growth rate,%)=[(末體長-初體長)/初體長]×100；全長增長率(whole length growth rate,%)=[(末全長-初全長)/初全長]×100；特定生長率(specific growth rate,SGR,%/d)=[(ln末重-ln初重)/天數(shù)]×100；肥滿度(condition factor,CF,g/cm3)=(末重/體長3)×100；肝臟指數(shù)(hepatosomatic index,HSI,%)=(肝臟重/體重)×100；脾臟指數(shù)(spleen index,%)=(脾臟重/體重)×100；飼料系數(shù)(feed conversion ratio,FCR)=飼料消耗量/增重。

1.5.5.2 胃腸道消化酶活性

將胃腸道組織解凍，剁碎，加入適量0.85%生理鹽水，充分混勻，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液測定蛋白酶和淀粉酶活性。

蛋白酶活性采用福林-酚試劑法[15]測定，酶活性單位定義為：1 mL酶液每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量為1個酶活性單位，以U/mL表示。酪氨酸含量(y)與OD680(x)的關(guān)系式為：y=162.24x-0.537 5(R2=0.998 7)。

蛋白酶活性=(A×K×4/10)×n。

式中：A×K為將OD680代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的值；4為4倍，即0.8 mL反應(yīng)液取出0.2 mL；10為反應(yīng)時間10 min；n為稀釋倍數(shù)。

淀粉酶活性采用碘比色法[16]測定，酶活性單位定義為：在一定反應(yīng)條件下1 h內(nèi)將1 g可溶性淀粉轉(zhuǎn)化為糊精的酶量為1個酶活性單位，以U/g表示。淀粉含量(y)與OD660(x)的關(guān)系式為：y=6.535 0x+0.294 7(R2=0.993 0)。

淀粉酶活性=[(60/T)×(△A-b)/K]×n/V。

式中：(△A-b)/K為將OD660代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的值；T為反應(yīng)時間(min)；n為稀釋倍數(shù)；V為酶液體積(mL)。

1.5.5.3 血清生化指標(biāo)

將血清解凍，測定酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、過氧化氫酶(CAT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性和丙二醛(MDA)、總蛋白(TP)含量。ACP、AKP、CAT、ALT和AST活性和MDA含量的測定按照試劑盒說明書進(jìn)行。TP含量采用考馬斯亮藍(lán)G250染色法[17]進(jìn)行測定，牛血清白蛋白(BSA)含量(y)與OD595(x)的關(guān)系式為：y=22.874x+8.134 8(R2=0.999 4)。

蛋白質(zhì)含量(mg/mL)=A×n×10-3/V。

式中：A為由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到的蛋白質(zhì)含量(μg)；n為稀釋倍數(shù)；V為樣品體積(mL)。

1.5.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為P<0.05，極顯著性水平設(shè)為P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆粕發(fā)酵工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，結(jié)果見表3。綜合小肽、游離氨基酸和乳酸含量，確定最優(yōu)組合為：A1B3C3D3，即發(fā)酵溫度37 ℃，枯草芽孢桿菌接種量4%(v/m)，枯草芽孢桿菌與植物乳桿菌接種比例1∶5，接種方式為接種枯草芽孢桿菌2 d后接種植物乳桿菌，共發(fā)酵5 d。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 3 Analysis of orthogonal test results

續(xù)表3序號 No.因素 FactorsABCD小肽含量Small peptides content/(mg/g)游離氨基酸含量Free amino acids content/(μg/g)乳酸含量Lactic acid content/(μg/g)游離氨基酸含量Free amino acid contentK11 045.231 074.351 207.07763.26K21 139.491 138.771 028.391 254.51K31 207.291 178.891 156.551 374.24R 162.06 104.54 178.68 610.98 最佳組合Best combi-nationA3B3C1D3主次順序 Primary and secondary orderD>C>A>B乳酸含量Lactic acid contentK11 383.511 383.071 395.931 512.24K21 514.201 366.751 345.821 297.84K31 353.321 501.211 509.281 440.95R160.88134.46163.46 214.40最佳組合Best combinationA2B3C3D1主次順序 Primary and secondary orderD>C>A>B

2.2 發(fā)酵豆粕性能評價

2.2.1 抗原蛋白降解情況

由圖1可以看出，相比于未發(fā)酵豆粕，發(fā)酵豆粕中的7S和11S抗原蛋白得到有效降解，且15 ku以下小分子蛋白質(zhì)含量增加，營養(yǎng)價值提高。

泳道1：未發(fā)酵豆粕；泳道2：發(fā)酵豆粕；M:Marker。Lane 1: unfermented soybean meal; lane 2: fermented soybean meal; M: Marker.圖1 發(fā)酵豆粕與未發(fā)酵豆粕SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of fermented soybean meal and unfermented soybean meal

2.2.2 有益成分含量對比

由表4可知，發(fā)酵豆粕小肽含量達(dá)751.440 mg/g，較未發(fā)酵豆粕提高161%；游離氨基酸含量達(dá)388.623 μg/g，較未發(fā)酵豆粕提高17.87倍；乳酸含量達(dá)390.165 μg/g；枯草芽孢桿菌與植物乳桿菌活菌數(shù)均達(dá)1010CFU/g。

表4 發(fā)酵豆粕與未發(fā)酵豆粕有益成分含量比較Table 4 Comparison of beneficial component contents in fermented soybean meal and unfermented soybean meal

2.2.3 不良寡糖TLC分析

發(fā)酵后豆粕中的不良寡糖水蘇糖與棉子糖被完全分解(圖2)。此外，從TLC圖還可以看出豆粕中還有一種未知寡糖經(jīng)過發(fā)酵作用得到去除。

2.3 大黃魚養(yǎng)殖效果評價

2.3.1 發(fā)酵豆粕替代部分魚粉對大黃魚生長性能和形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響

由表5可知，大黃魚的成活率、增重率、體長增長率、全長增長率、特定生長率、肥滿度、肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和飼料系數(shù)在各組之間均沒有顯著差異(P>0.05)。

表5 發(fā)酵豆粕替代部分魚粉對大黃魚生長性能和形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響Table 5 Effects of partial replacement fish meal by fermented soybean meal on growth performance and morphological indexes of large yellow croaker

2.3.2 發(fā)酵豆粕替代部分魚粉對大黃魚胃腸道消化酶活性的影響

由表6可知，大黃魚的胃腸道蛋白酶和淀粉酶活性在各組之間均無顯著差異(P>0.05)。

表6 發(fā)酵豆粕替代部分魚粉對大黃魚胃腸道消化酶活性的影響Table 6 Effects of partial replacement fish meal by fermented soybean meal on intestinal digestive enzyme activities of large yellow croaker U/g

2.3.3 發(fā)酵豆粕替代部分魚粉對大黃魚血清生化指標(biāo)的影響

由表7可知，大黃魚血清ACP、AKP、CAT、ALT、AST活性與MDA含量各組之間均無顯著差異(P>0.05)，但FM組和FSBM-50組的血清TP含量顯著高于FSBM-30組(P<0.05)。

表7 發(fā)酵豆粕替代部分魚粉對大黃魚血清生化指標(biāo)的影響Table 7 Effects of partial replacement fish meal by fermented soybean meal on serum biochemical indexes of large yellow croaker

1：水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)品；2：棉子糖標(biāo)準(zhǔn)品；3：未發(fā)酵豆粕；4：發(fā)酵豆粕。1: stachyose standard; 2: raffinose standard; 3: unfermented soybean meal; 4: fermented soybean meal.圖2 薄層色譜分析發(fā)酵豆粕中的不良寡糖Fig.2 TLC analysis of unhealthy oligosaccharides of fermented soybean meal

3 討 論

3.1 發(fā)酵豆粕替代部分魚粉對大黃魚生長性能的影響

豆粕中存在的抗?fàn)I養(yǎng)因子會對魚類生長性能造成一定影響。本研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵豆粕替代50%的魚粉對大黃魚的生長性能和形態(tài)學(xué)指標(biāo)沒有顯著影響，這與張帆等[18]對大黃魚的研究結(jié)論一致，即豆粕替代45%的魚粉對大黃魚的增重率、特定生長率、飼料系數(shù)和成活率未產(chǎn)生顯著影響。Li等[19]研究表明，希瓦氏菌MR-7發(fā)酵豆粕后胰蛋白酶抑制劑、大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白、棉子糖和水蘇糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量分別降低了(90.19±0.42)%、(77.36±0.14)%、(84.52±0.18)%、(29.25±1.28)%和(24.25±1.84)%，可以替代大菱鲆飼料中45%的魚粉而不影響其生長性能和飼料利用率。豆粕經(jīng)過微生物發(fā)酵后，抗?fàn)I養(yǎng)因子得以消除，因而適宜替代水平下不會對大黃魚的生長產(chǎn)生不良影響。本試驗(yàn)中，由于試驗(yàn)中期爆發(fā)海水溫水魚類養(yǎng)殖最常見、經(jīng)濟(jì)損失也最大的淀粉卵渦鞭蟲病，病魚鰓和體表肉眼可見許多小白點(diǎn)，因養(yǎng)殖經(jīng)驗(yàn)不足對病魚沒有及早發(fā)現(xiàn)，及時治療，這種以包囊繁殖的疾病造成魚體在極短時間內(nèi)大批量死亡和消瘦，加上后期藥浴治療期間停止投喂1周，造成試驗(yàn)魚存活和增重效果普遍不佳。

3.2 發(fā)酵豆粕替代部分魚粉對大黃魚消化性能的影響

消化酶活性高低直接反映機(jī)體的消化吸收能力和環(huán)境適應(yīng)力[20]?？乖鞍椎拇嬖跁p傷大西洋鮭和虹鱒腸道結(jié)構(gòu)，降低消化酶活性[21]；不良寡糖棉子糖和水蘇糖的存在會降低牙鲆胃腸道中蛋白酶的活性，影響消化性能[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SBM-30組和FSBM-50組大黃魚的腸道蛋白酶活性略高于和FM組。這可能是因?yàn)樵囼?yàn)組中添加的發(fā)酵豆粕經(jīng)過酶解和微生物分解，使得能抑制養(yǎng)殖動物腸道消化酶活性的各種抗?fàn)I養(yǎng)因子被去除，易于吸收的小肽和游離氨基酸含量提高，并且益生菌及其分泌的酶進(jìn)入動物消化道的“酶池”，一定程度上有助于調(diào)節(jié)宿主腸道微生態(tài)平衡和提高動物的消化率，最終表現(xiàn)為FSBM-30和FSBM-50組飼料系數(shù)降低。

3.3 發(fā)酵豆粕替代部分魚粉對大黃魚非特異性免疫功能和抗氧化能力的影響

魚類血液指標(biāo)可反映機(jī)體的營養(yǎng)、代謝及健康狀況，血液指標(biāo)會隨生理或病理指標(biāo)的改變而變[23]。對免疫指標(biāo)的測定能反映出飼料蛋白質(zhì)源對動物的適合程度[24]。ACP和AKP是動物新陳代謝過程中重要的調(diào)控酶，受營養(yǎng)狀況、環(huán)境變化、疾病和生長階段的影響，對動物生存具有重要意義[25]?？寡趸甘莿游餀C(jī)體健康和對外界刺激反應(yīng)的重要指標(biāo)，CAT活性、MDA含量已被較多研究者用于評估蛋白質(zhì)替代源對魚類抗氧化能力的影響[26]。CAT能催化過氧化氫(H2O2)分解為水(H2O)和氧氣(O2)[27]，使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，促進(jìn)細(xì)胞呼吸，提高機(jī)體的免疫防御能力[28]。MDA是脂質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物，可作為生物體內(nèi)源性氧化損傷的重要標(biāo)志物[7]。ALT和AST是水產(chǎn)動物體內(nèi)重要的免疫酶和氨基酸代謝酶，其在血液中活性的升高是肝臟發(fā)病的病理指標(biāo)之一，是肝臟受損的靈敏指標(biāo)[29]。已有研究報道，飼料中的豆粕可能會引起鱸魚[7]和金頭鯛[30]等魚類的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并且豆粕中的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白會破壞魚類的抗氧化系統(tǒng)，引起氧化損傷[31-32]。FM組和FSBM-50組大黃魚血清TP含量顯著高于FSBM-30組，由于動物血清TP含量可以反映肝臟健康狀況和飼料質(zhì)量[33]，上述結(jié)果說明發(fā)酵豆粕替代比例達(dá)到50%時大黃魚的營養(yǎng)和健康水平與全魚粉對照組相當(dāng)。這與王賽等[34]用發(fā)酵豆粕替代褐點(diǎn)石斑魚飼料中20%魚粉時的研究結(jié)論一致，發(fā)酵豆粕替代飼料中20%魚粉時石斑魚血清TP含量下降。從本研究結(jié)果看，盡管各組之間大黃魚抗氧化能力和肝臟健康狀況無顯著差異，ALT和AST活性測定結(jié)果仍然顯示FM組大黃魚肝臟可能受到輕微損傷，因而免疫機(jī)能下降，成活率降低，而FSBM-30組和FSBM-50組雖然飼料原料含植物性蛋白質(zhì)源，但經(jīng)過植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌的發(fā)酵作用，豆粕中對魚類的抗氧化系統(tǒng)具有損傷作用的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白被完全去除，同時富含益生菌和消化酶，因而在一定程度上提高了大黃魚的抗病力和抗氧化能力。

4 結(jié) 論

① 發(fā)酵最優(yōu)工藝條件為：基質(zhì)含水量50%，發(fā)酵溫度37 ℃，枯草芽孢桿菌接種量4%(v/m)，枯草芽孢桿菌與植物乳桿菌接種比例1∶5，接種方式為接種枯草芽孢桿菌2 d后接種植物乳桿菌，共發(fā)酵5 d；在此條件下，7S、11S抗原蛋白和棉子糖、水蘇糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子成分有效去除，易于吸收的小肽和游離氨基酸含量顯著提高，富含益生菌和乳酸，產(chǎn)品營養(yǎng)價值和適口性提高。

② 發(fā)酵豆粕可替代飼料中50%的魚粉而不會對大黃魚的生長性能、消化性能和非特異性免疫功能和抗氧化能力產(chǎn)生不良影響。