吳坤鑫等

摘 要 為明確擬南芥At2g04450啟動(dòng)子對靶標(biāo)基因表達(dá)的啟動(dòng)作用，根據(jù)已報(bào)道的擬南芥基因組序列設(shè)計(jì)合成1對引物，以擬南芥基因組DNA為模板克隆At2g04450上游調(diào)控序列，并與pBAR-GUS中間表達(dá)載體相連構(gòu)建植物表達(dá)載體p04450p-GUS，采用農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)的滲透法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，以GUS為報(bào)告基因研究該調(diào)控序列的組織表達(dá)特異性以及病原菌PstDC3000對該啟動(dòng)子的誘導(dǎo)表達(dá)效果。結(jié)果表明：獲得At2g04450上游調(diào)控序列，該序列不僅具有啟動(dòng)子活性，并且具有組織特異性，GUS基因主要在根特異表達(dá)；病原菌PstDC3000對該啟動(dòng)子的表達(dá)沒有誘導(dǎo)作用。本結(jié)果將為研究At2g04450的功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 At2g04450啟動(dòng)子；GUS活性；組織表達(dá)特異性

中圖分類號 Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Molecular Cloning and Activity Analysis of a Promoter of

an Arabidopsis thaliana Gene At2g04450

WU Kunxin1，ZHANG Xiuchun1，CHEN Xiongting1，LIU Zhixin1，PENG Ming1，2*

1 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences/Key Laboratory

of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops，Ministry of Agriculture，Haikou，Hainan 571101，China

2 Environmental Safety Supervision and Inspection Centre for Genetically Modified Plants and Microorganisms

used in Plants，Ministry of Agriculture，Haikou，Hainan 571101，China

Abstract 5′-UTR of At2g04450 gene was cloned by PCR from Arabidopsis thaliana. To investigate the tissue expression pattern and the possible response to pathogen infection of the cloned regulatory sequence，an expression vector containing this sequence fused with GUS was constructed for transformation into A. thaliana by using agrobacterium-mediated method. Histochemical staining of transgenic A. thaliana showed that GUS reporter gene was predominantly expressed in roots，and the activity of the promoter can not be induced by the PstDC3000. This research will facilitate the study of At2g04450 gene function.

Key words At2g04450 promoter；GUS activity；Tissue specificity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.010

At2g04450命名為AtNUDT6，是分布于擬南芥細(xì)胞質(zhì)中的 Nudix水解酶基因[1]。Nudix（Nucleoside diphosphates linked to some moiety X）水解酶是需要Mg2+的一類酶，這類酶的共同特征是含有高度保守的由23個(gè)氨基酸殘基組成的Nudix基序（motif/box），廣泛存在于包括病毒、細(xì)菌、真核生物在內(nèi)的250多種生物中。細(xì)菌和人類Nudix至少具有2大功能，一是清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的有害代謝產(chǎn)物；二是調(diào)節(jié)各生化途徑的中間代謝產(chǎn)物的積累[1]。

與人類和大腸桿菌相比，植物Nudix水解酶基因家族的研究起步比較晚。擬南芥基因組全序列分析發(fā)現(xiàn)擬南芥至少存在24個(gè)Nudix水解酶基因，分布于細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和線粒體中。目前對Nudix 水解酶基因家族的了解還不夠充分，甚至在某些認(rèn)識上存在矛盾。擬南芥第一個(gè)Nudix 水解酶基因（AtNUDT1），體外生化分析發(fā)現(xiàn)AtNUDT1是一個(gè)NADH焦磷酸化酶，在體內(nèi)生理狀態(tài)下表現(xiàn)為具有對葉酸前體物質(zhì)和（脫氧）核苷三磷酸的水解酶活性，表明AtNUDT1是一個(gè)雙功能酶[2-3]。Ogawa等[4]研究顯示，AtNUDT2、AtNUDT6、AtNUDT7和AtNUDT10 在體外實(shí)驗(yàn)中均可水解ADP-ribose和NADH，且過量表達(dá)AtNUDT2能增強(qiáng)擬南芥的抗氧化能力[4]。Bartsch等[5]的研究結(jié)果也提示，AtNUDT2、AtNUDT6、AtNUDT7 和AtNUDT10 可以通過水解細(xì)胞內(nèi)ADP-ribose 從而減少游離ADP-ribose對細(xì)胞的傷害作用，但它們在植物體內(nèi)的實(shí)際作用還有待于進(jìn)一步研究。

哺乳動(dòng)物中NUDT6被證明能夠調(diào)節(jié)纖維原細(xì)胞生長因子的表達(dá)[6]，并且還可能通過對生長信號的反應(yīng)來調(diào)節(jié)增值[7]。Ishikawa等[8]研究表明擬南芥AtNUDT6在轉(zhuǎn)錄后水平受綠茶兒茶酸的負(fù)調(diào)控，但在依賴于NPR1的水楊酸信號傳導(dǎo)途徑中起正調(diào)控作用。目前尚未見At2g04450啟動(dòng)子活性分析的相關(guān)報(bào)道。本研究從擬南芥中獲得At2g04450上游調(diào)控序列，并以它驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)，明確其對靶基因表達(dá)的啟動(dòng)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 擬南芥（Arabidopsis thaliana）哥倫比亞生態(tài)型為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 藥品與試劑 pMD18-T vector 購自TaKaRa公司；分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)用各種限制性內(nèi)切酶、連接酶等購自Promaga公司；生化試劑購自Sigma公司；大腸桿菌（E. coli）DH5α、 根癌農(nóng)桿菌（Agrob-acterium tumefaciens）GV3101、 載體pBAR-GUS、 病原菌Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000（PstDC3000）為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 At2g04450啟動(dòng)子的分離、克隆和測序 采用試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取高純度擬南芥基因組DNA，具體按試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)GenBank序列（登錄號：CP002685.1），設(shè)計(jì)At2g04450上游非編碼區(qū)的特異引物04450p-F： TCAAAGATACCGGACTGTGGAAGC和04450p-R： AACTAGTCCATATTCTAAGAAAACCCAAGTTC（圖2），以擬南芥基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-T質(zhì)粒，按Sambrook等[9]方法，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選獲得重組質(zhì)粒。采用用ABI Prism 377測序儀進(jìn)行測定。利用數(shù)據(jù)庫PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp）和PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對啟動(dòng)子調(diào)控元件進(jìn)行預(yù)測分析。

1.2.2 04450p：：GUS植物表達(dá)載體的構(gòu)建 克隆的04450p啟動(dòng)子片段用AgeI和SpeI進(jìn)行雙酶切，將釋放出的外源片段與經(jīng)AgeI和SpeI雙酶切的載體pBAR-GUS相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，搖菌并抽提質(zhì)粒。將酶切鑒定正確的克隆用凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株中。

1.2.3 擬南芥轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化方法采用花序浸泡法[10]，抗性植株的篩選參照張秀春等[11]進(jìn)行。

1.2.4 抗性植株P(guān)CR檢測 采用NaOH法快速提取抗性植株基因組DNA，以葉片基因組DNA為模板，BAR-219F（GGTCTGCACCATCGTCAACCACTA

CA）和BAR-671R（GGCAGGCTGAAGTCCAGCTGCC

AGAA）為引物，PCR反應(yīng)體系參照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 病原菌的培養(yǎng)和接種 病原菌的培養(yǎng)按Whalen等[12]方法進(jìn)行。將培養(yǎng)好的病原菌以10 mmol/L MgCl2稀釋至OD600=0.1，用沒有針頭的注射器器口緊貼葉片背面，然后用力緩慢推注射器使菌液完全注入右半片葉子，直到注射的右半葉片濕潤為止。本研究以8個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系為試驗(yàn)材料，重復(fù)3次。每株系接6個(gè)重復(fù)（6棵），每個(gè)重復(fù)接種3片葉子，分別取注射1、5、24 h后的葉片進(jìn)行GUS活性的組織化學(xué)染色分析，以注射10 mmol/L MgCl2的葉片為對照。

1.2.6 GUS活性的組織化學(xué)染色分析 種植T3代純合植株，分別取不同時(shí)期及不同組織的材料進(jìn)行GUS染色[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 At2g04450基因啟動(dòng)子片段的擴(kuò)增

以擬南芥Col-0生態(tài)型的總基因組DNA為模板，用特異引物04450p-F和04450p-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得1 405 bp的At2g04450上游調(diào)控序列（圖1-a），命名為04450p。將擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后在含X-Gal和IPTG的固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行重組子的篩選，并對其中1個(gè)白斑用AgeI和SpeI進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖1-b所示，待鑒定質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物與預(yù)期大小相同，將該重組質(zhì)粒命名為pMD18-04450p。pMD18-04450p序列分析表明，克隆的04450p與GenBank中登錄的序列（登錄號：CP002685.1）一致。

2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

用AgeI和SpeI酶切重組質(zhì)粒pMD18-04450p，回收1 400 bp左右的目的片段，并插入到pBAR-GUS載體的GUS報(bào)告基因上游，所得重組質(zhì)粒經(jīng)AgeI和SpeI進(jìn)行雙酶切鑒定，獲得預(yù)期大小的目的片段，結(jié)果如圖2所示，經(jīng)鑒定的重組子命名p04450p-GUS。通過凍融法，將獲得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌株，提取質(zhì)粒并經(jīng)AgeI和SpeI雙酶切驗(yàn)證（圖略）后用于擬南芥轉(zhuǎn)化。

2.3 抗性植株P(guān)CR檢測

用滲透轉(zhuǎn)化法，將p04450p-GUS轉(zhuǎn)入擬南芥，經(jīng)除草劑抗性篩選獲得33株抗性植株。以BAR-219F和BAR-671R為引物，對抗性植株進(jìn)行PCR檢測，部分結(jié)果如圖3所示。其擴(kuò)增結(jié)果均與質(zhì)粒p04450p-GUS的擴(kuò)增結(jié)果相同，在250～500 bp之間出現(xiàn)一條明亮條帶，大小與預(yù)期一致，證明此抗性植株均含有bar基因片段，獲得了轉(zhuǎn)基因04450p：：GUS植株。

2.4 At2g04450啟動(dòng)子在不同組織中的活性分析

將篩選出的轉(zhuǎn)基因04450p：：GUS植株T3代純合子進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果表明野生型擬南芥（對照）幼苗和花序（圖4-a，4-f）沒有GUS表達(dá)，而轉(zhuǎn)基因04450p：：GUS植株的表達(dá)情況（圖4-c～e， h～j）與CaMV35S[14]（圖4-b， 4-g）、AtNUDT8[15]、AtNUDT5[16]等組成型表達(dá)啟動(dòng)子完全不同，表現(xiàn)為2周大的轉(zhuǎn)基因幼苗葉片除在頂端和兩側(cè)的3點(diǎn)外其余部位均沒有檢測到GUS信號（圖4-c， 4-d），而根部只有側(cè)根中間部分檢測到GUS表達(dá)信號（圖4-j），但是在蓮座葉（圖4-e）、整個(gè)花序（圖4-h）、果莢（圖4-i）沒有檢測到GUS表達(dá)信號。本結(jié)果顯示，所分離克隆的片段具有啟動(dòng)子功能并且有一定的組織特異性。

2.5 病原菌PstDC3000對At2g04450啟動(dòng)子的誘導(dǎo)表達(dá)分析

病原菌PstDC3000的誘導(dǎo)表達(dá)分析如圖5所示，與已報(bào)道的受病原菌誘導(dǎo)的04430p：：GUS轉(zhuǎn)基因植株GUS表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而加強(qiáng)不同[17]，病原菌PstDC3000 誘導(dǎo)1、5、24 h 后的04450p：：GUS轉(zhuǎn)基因植株GUS的表達(dá)與注射10 mmol/L MgCl2 24 h后的對照并沒有區(qū)別，均沒有GUS活性，說明病原菌PstDC3000 對At2g04450 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)沒有誘導(dǎo)作用。

3 討論與結(jié)論

本研究中At2g04450啟動(dòng)子在不同組織中的活性分析結(jié)果顯示，該啟動(dòng)子的活性在根中明顯高于其他部位，這與Ogawa等[1]的研究報(bào)道At2g04450在根中的轉(zhuǎn)錄水平明顯低于莖和葉不同，其原因可能是由于培養(yǎng)條件不同所致。Jambunathan等[17]報(bào)道野生型擬南芥（Col-0）的AtNUDT2，AtNUDT6和 AtNUDT7在營養(yǎng)豐富程度不同的培養(yǎng)基質(zhì)中表達(dá)水平有所差異。

病原菌PstDC3000對At2g04450啟動(dòng)子的誘導(dǎo)表達(dá)分析結(jié)果顯示，該病原菌對At2g04450啟動(dòng)子沒有誘導(dǎo)作用，該結(jié)果與Adams-Phillips等[18]報(bào)道的病原菌PstDC3000對擬南芥At2g04450基因的表達(dá)沒有誘導(dǎo)作用相一致。此外，其與該序列的生物信息學(xué)分析結(jié)果相吻合，在04450p序列中除包含基本的啟動(dòng)元件及大量的CAAT盒外，還包含MBS元件（干旱誘導(dǎo)相關(guān)）、HSE元件（熱脅迫相關(guān)）以及與光響應(yīng)有關(guān)的ACCT-motif、GAG-motif、 TCT-motif、G-box及MRE元件（圖6），表明該序列不僅具有啟動(dòng)子活性，而且還可能具有多重因子的誘導(dǎo)活性。但是該啟動(dòng)子缺乏與病原菌誘導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件GCC 類元件和W-boxes元件[19-20]等。W-box[（T）TGAC（C/T）]是植物特有的超基因家族WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。越來越多的證據(jù)表明，W-boxes是許多病原誘導(dǎo)植物基因的主要順式作用元件。串連排列的W-box往往與病原的誘導(dǎo)特性有關(guān)。

本研究成功地克隆擬南芥At2g04450的啟動(dòng)子04450p，并與pBAR-GUS相連構(gòu)建了植物表達(dá)載體p04450p-GUS，采用農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)的滲透法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，通過除草劑篩選獲得了一批抗性純合子轉(zhuǎn)基因植株。然后對轉(zhuǎn)基因植株2周幼苗進(jìn)行GUS活性的組織化學(xué)染色分析，并對3.5～4周的轉(zhuǎn)基因植株葉片進(jìn)行病原菌誘導(dǎo)表達(dá)分析。結(jié)果顯示該啟動(dòng)子具有一定的組織特異性，并且病原菌PstDC3000對該啟動(dòng)子的表達(dá)沒有誘導(dǎo)作用。本研究將為擬南芥At2g04450的功能研究提供參考。

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