何瑜林

摘 要：采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)陸川豬及其肉制品進(jìn)行鑒偽識(shí)別，利用ISSR技術(shù)，對(duì)純種陸川豬、陸川豬雜交品種（二元雜豬和三元雜豬）及廣西本地的巴馬香豬和環(huán)江香豬的DNA指紋圖譜進(jìn)行分析。結(jié)果表明：從34 條引物中篩選出3 條帶型清晰、重復(fù)性好的引物WM12、WM27、WM10，其中引物WM12可用于鑒別陸川豬、二元雜豬和三元雜豬的生鮮樣品及臘肉制品，引物WM27可用于鑒別陸川豬和巴馬香豬的生鮮樣品及臘肉制品，引物WM10用可于鑒別陸川豬和環(huán)江香豬的生鮮樣品及臘肉制品。ISSR技術(shù)可快速準(zhǔn)確的鑒定陸川豬、陸川豬雜交品種、巴馬香豬、環(huán)江香豬及其肉制品。

關(guān)鍵詞：陸川豬；分子標(biāo)記技術(shù)；ISSR

Abstract： In this study， species identification of Luchuan pig meat and meat products was carried out by DNA fingerprint profiling of meats from purebred Luchuan， hybrid Luchuan， Bama miniature and Huangjiang miniature pigs using ISSR （inter-simple sequence repeat） molecular markers. The results showed that 3 clear and repeatable primer pairs WM12， WM27 and WM10 were selected from 34 primers. WM12 was useful for discriminating fresh and cured meat from purebred Luchuan and hybrid Luchuan pigs， while Luchuan pigs could be distinguished from Bama miniature pigs by using WM27， and from Huangjiang miniature pigs by using WM10. In conclusion， the ISSR method enables rapid and accurate identification of fresh meat and meat products from purebred Luchuan， hybrid Luchuan， Bama miniature and Huangjiang miniature pigs.

Key words： Luchuan pigs； molecular marker technology； inter-simple sequence repeat （ISSR）

中圖分類號(hào)：TS251.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2014）10-0010-05

陸川豬是中國(guó)八大地方優(yōu)良豬種之一，屬于國(guó)家級(jí)保護(hù)品種。因其原產(chǎn)于廣西省東南部的陸川縣而得名。其畜產(chǎn)品可加工成香腸、無(wú)皮五花臘肉、白切豬腳、脆皮乳豬、扣肉等肉制品，受到廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。但市場(chǎng)上的陸川豬肉制品真?zhèn)坞y辨，目前針對(duì)陸川豬及其雜交品種的肉質(zhì)研究主要是通過(guò)測(cè)定豬胴體和肉質(zhì)特征來(lái)評(píng)價(jià)生鮮肉及其肉制品品質(zhì)，如瘦肉率、嫩度、pH 值、肉色等，但是由于飼養(yǎng)條件和豬個(gè)體存在差異，且測(cè)定過(guò)程中對(duì)供試樣品的采集時(shí)間和取樣部位有要求，所以測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定不可靠。因此探索快捷、準(zhǔn)確的分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行陸川豬純種的鑒偽，對(duì)陸川豬的發(fā)展有重要意義。

DNA分子標(biāo)記（DNA molecular marker）是以生物大分子的多態(tài)性為基礎(chǔ)的一種遺傳標(biāo)記，它是DNA水平遺傳多樣性的直接反映。DNA多態(tài)性在作物的遺傳育種和品種鑒定中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。畜牧業(yè)方面，黃敏瑞[1]、孫俊麗[2]等利用DNA多態(tài)性分析了陸川豬與華南其他品種豬的遺傳進(jìn)化關(guān)系；還有利用DNA分子鑒定技術(shù)將牦牛與黃牛等加以區(qū)分的報(bào)道[3]。ISSR（inter-simple sequence repeat）標(biāo)記是在SSR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一類新型分子標(biāo)記技術(shù)，以其較低的成本、簡(jiǎn)單的操作、良好的穩(wěn)定性、重復(fù)性、多態(tài)性豐富以及能較好地反映物種的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性變化等特點(diǎn)，被視為理想的遺傳標(biāo)記方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用在品種鑒定、物種的分類以及居群生物學(xué)的研究中[4-5]。但是它在PCR擴(kuò)增階段需要一定時(shí)間來(lái)摸索最適反應(yīng)條件，且是顯性遺傳標(biāo)記，不能區(qū)分顯性純合基因型和雜合基因型。SSR和ISSR技術(shù)在食品溯源中主要應(yīng)用在糧食作物、水果品種、蔬菜品種、動(dòng)物產(chǎn)品的鑒別以及其他經(jīng)濟(jì)作物如橄欖樹(shù)[6]、條斑紫菜等的鑒別中。Nagaraju等[7]用熒光ISSR和熒光SSR方法鑒定Basmati和非Basmati大米，在研究中分別用這兩種方法繪制了指紋圖譜，并進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果顯示，這兩種方法都顯示了良好的分辨率、重復(fù)性和靈敏度，兩種方法的結(jié)合可以很好的將一些品種區(qū)分開(kāi)來(lái)。Montemurro等[8]采用SSR和擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）法鑒定112 個(gè)油橄欖品種，從27 條SSR引物中得到多態(tài)性圖譜引物對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并從AFLP引物序列中篩選出3對(duì)引物用于區(qū)分所有112 個(gè)樣品。目前，用DNA分子鑒定技術(shù)來(lái)鑒別肉制品源性的研究并不多，特別是用于陸川豬及其產(chǎn)品的真?zhèn)舞b別的研究較少。鑒于目前的研究現(xiàn)狀以及對(duì)陸川豬品牌產(chǎn)品的保護(hù)，本課題提取陸川豬及其雜交品種、巴馬香豬和環(huán)江香豬及其肉制品的總DNA，用ISSR法分析DNA多態(tài)性，探索可用于鑒偽識(shí)別的陸川豬的檢驗(yàn)方法，開(kāi)發(fā)陸川豬及其肉制品的DNA分子鑒定技術(shù)。這對(duì)規(guī)范陸川豬市場(chǎng)和深加工企業(yè)的經(jīng)營(yíng)行為，引導(dǎo)深加工企業(yè)的健康發(fā)展以及維護(hù)“陸川豬”品牌形象具有重要意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果與分析

采用改良后的SDS法提取樣品的DNA，經(jīng)過(guò)純化回收后，通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)得到的條帶比較清晰，片段大小一致，無(wú)降解現(xiàn)象，無(wú)明顯的RNA條帶干擾和污染。經(jīng)過(guò)DNA純度檢測(cè)，所提DNA樣品OD260 nm/OD280 nm比值均在1.7～2.0之間，表明DNA純度能滿足后續(xù)ISSR反應(yīng)的需要。

由于臘肉制品特別是扣肉制品在制作過(guò)程中經(jīng)過(guò)將近200 ℃的高溫油炸，DNA破壞比較嚴(yán)重，這也給提取造成一定困難，但用此方法提取到的臘肉制品的DNA質(zhì)量較好，與生鮮肉提到的DNA質(zhì)量相差無(wú)幾，且方法簡(jiǎn)單、操作方便、成本低廉，比文獻(xiàn)[16]中提到的采用試劑盒、異硫氰酸胍法[17]、酚-氯仿抽提法[18]等方法更加實(shí)用和簡(jiǎn)單。

2.2 樣品的ISSR檢測(cè)結(jié)果與分析

2.2.1 純種陸川豬及其雜交品種ISSR檢測(cè)結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)分別對(duì)生鮮豬肉和臘肉制品進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和帶型分析，在設(shè)計(jì)合成的34 個(gè)引物中，篩選出了1 個(gè)多態(tài)性好，條帶清晰的引物（WM12：5-CTCCTCCTCGC-3）可用于區(qū)別陸川豬、二元雜豬和三元雜豬。如圖1所示，引物WM12在陸川豬與二元雜豬、三元雜豬樣品擴(kuò)增獲得900～1 000 bp特異帶，其在二元雜豬、三元雜豬均有出現(xiàn)，而陸川豬沒(méi)有此條帶產(chǎn)生。同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在陸川豬與二元雜豬、三元雜豬的扣肉樣品中，在大約900 bp處，5 頭陸川豬均沒(méi)有條帶產(chǎn)生，而其他的長(zhǎng)陸二元雜、大陸二元雜、外三元雜、龍寶豬和內(nèi)三元雜均有一條比較清晰的條帶產(chǎn)生。說(shuō)明此引物能夠?qū)㈥懘ㄘi與二元雜豬、三元雜豬的生鮮樣品和臘肉樣品區(qū)分。

在34 個(gè)引物中，篩選出了1 個(gè)引物（WM10：5-CACCACCACGC-3）用于區(qū)別陸川豬和環(huán)江香豬。如圖3所示，引物WM10在陸川豬與環(huán)江香豬生鮮肉樣品擴(kuò)增獲得800～900 bp之間和500～600 bp之間2 條特異帶，陸川豬生鮮樣品均有這兩條特異帶，而在環(huán)江香豬生鮮肉樣品中均沒(méi)有這兩條特異條帶。而在陸川豬與環(huán)江香豬臘肉制品電泳圖譜中，在900 bp有特異帶，在陸川豬臘肉樣品中均有出現(xiàn)，但是在環(huán)江香豬臘肉樣品中沒(méi)有出現(xiàn)。說(shuō)明引物能夠?qū)㈥懘ㄘi和環(huán)江香豬的生鮮樣品和臘肉樣品區(qū)分。

3 討 論

陸川豬的養(yǎng)殖已從過(guò)去的農(nóng)戶散養(yǎng)發(fā)展成現(xiàn)在規(guī)?；酿B(yǎng)殖，肉制品加工產(chǎn)業(yè)也得到了迅速的發(fā)展。但是，市場(chǎng)上利用雜交豬冒充陸川豬的現(xiàn)象卻層出不窮。傳統(tǒng)的胴體品質(zhì)和肉質(zhì)品質(zhì)評(píng)價(jià)可以大致體現(xiàn)陸川豬與其他品種豬的差別[19]，但卻沒(méi)有嚴(yán)格的界限，難以作為區(qū)別陸川豬及其他品種豬的標(biāo)準(zhǔn)。胴體品質(zhì)包括宰前活質(zhì)量、胴體質(zhì)量、胴體長(zhǎng)、屠宰率、瘦肉率、眼肌面積、膘厚、皮厚、骨質(zhì)量等指標(biāo)；肉質(zhì)指標(biāo)包括肉色、系水力、嫩度、pH值、大理石紋、肌肉脂肪、肌纖維直徑、游離氨基酸含量等指標(biāo)。一般的質(zhì)檢人員在實(shí)際操作中很難根據(jù)這些指標(biāo)鑒別陸川豬肉的真?zhèn)?。首先，供試樣品不易獲得，測(cè)定胴體指標(biāo)需要對(duì)整頭豬胴體進(jìn)行評(píng)價(jià)；測(cè)定肉質(zhì)指標(biāo)時(shí)，對(duì)豬的年齡、性別、樣品部位、宰后時(shí)間有嚴(yán)格的要求，這對(duì)于實(shí)驗(yàn)操作特別是市場(chǎng)采樣是不現(xiàn)實(shí)的。再者，這些指標(biāo)均受飼養(yǎng)條件和個(gè)體差異的影響，往往是不穩(wěn)定的，沒(méi)有統(tǒng)一的鑒別標(biāo)準(zhǔn)。另外，對(duì)加工變形后臘肉制品更是無(wú)法檢測(cè)。

而分子標(biāo)記技術(shù)直接以DNA的形式表現(xiàn)，具有很高的穩(wěn)定性，在生物體的各個(gè)組織及各個(gè)發(fā)育階段均穩(wěn)定存在，不受取樣部位、年齡、生長(zhǎng)條件等的限制。分子標(biāo)記技術(shù)操作簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉，準(zhǔn)確度高，結(jié)果穩(wěn)定可靠，易于實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)樣品多，一次可對(duì)100多份樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，具有高效、快捷、實(shí)用性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[20]。隨著科技的進(jìn)步，分子標(biāo)記技術(shù)也在不斷的發(fā)展和完善。ISSR 技術(shù)的應(yīng)用在動(dòng)物遺傳結(jié)構(gòu)研究的相關(guān)領(lǐng)域也逐漸被采納[21]。本實(shí)驗(yàn)利用ISSR技術(shù)探索一種可以快速準(zhǔn)確的對(duì)陸川豬及其肉制品進(jìn)行真?zhèn)舞b定的方法。

ISSR技術(shù)中，引物的設(shè)計(jì)具有隨機(jī)性和其擴(kuò)增結(jié)果具有不可預(yù)見(jiàn)性。一般要設(shè)計(jì)大量候選引物，而最終有效的引物卻為數(shù)極少。本研究設(shè)計(jì)了34 條，從中獲得3 條有效引物。其中，引物WM12（5-CTCCTCCTCGC-3）能夠區(qū)分陸川豬與其二元雜豬、三元雜豬；引物WM27（5-CTCCTCCTCAT-3）可以區(qū)分陸川豬和巴馬香豬的生鮮樣品及臘肉制品；引物WM10（5-CACCACCACGC-3）可用于區(qū)分陸川豬與環(huán)江香豬。韓曉磊等[22]從77 個(gè)ISSR引物中選出3 條引物對(duì)同為雅羅魚亞科魚類的鯰魚、草魚及赤眼鱒的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得出ISSR技術(shù)可以對(duì)形態(tài)特征差異不明顯的鯰魚、草魚和赤眼鱒進(jìn)行分子水平的區(qū)分鑒定，與本實(shí)驗(yàn)的研究有相同之處。筆者也注意到，同是陸川豬樣品，其擴(kuò)增得到的帶型并不完全一致，這也體現(xiàn)了陸川豬這一品種內(nèi)具有一定的遺傳多樣性，雖然如此，但是從陸川豬與其他品種的豬肉制品的各個(gè)電泳圖譜中可以清晰的看到其他豬肉制品具有特異帶，陸川豬是沒(méi)有的，可以依據(jù)這些特異性條帶對(duì)陸川豬進(jìn)行鑒定。

4 結(jié) 論

綜上所述，利用ISSR技術(shù)可快速準(zhǔn)確的鑒定陸川豬、陸川豬雜交品種、巴馬香豬、環(huán)江香豬及其肉制品。研究結(jié)果對(duì)規(guī)范陸川豬市場(chǎng)和深加工企業(yè)的經(jīng)營(yíng)行為，引導(dǎo)深加工企業(yè)的健康發(fā)展以及維護(hù)“陸川豬”品牌形象具有重要的意義，同時(shí)也為廣西地方豬的育種和標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖提供參考，也希望能為其他肉類產(chǎn)品的鑒偽識(shí)別提供可借鑒的技術(shù)方法。

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