張淑梅等

摘要 [目的]研究內(nèi)生細菌TF28對番茄灰霉病的誘導(dǎo)抗性。[方法] 采用生化測定方法研究內(nèi)生細菌TF28對番茄葉片6種防御酶活性和2種抗病信號分子含量的影響。[結(jié)果]內(nèi)生細菌處理后番茄葉片苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、脂氧合酶（LOX）、幾丁質(zhì)酶和β1，3葡聚糖酶活性明顯增強，6種防御酶最大活性分別為對照的2.7、2.5、1.6、1.5、2.7和4.1倍。水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）含量明顯上升，SA含量第7天最高，JA含量第3天最高，分別為對照的2.1和2.9倍。[結(jié)論]內(nèi)生細菌TF28可誘導(dǎo)提高防御酶活性抵抗番茄灰霉病侵染，誘導(dǎo)抗病信號傳導(dǎo)途徑可能與SA和JA介導(dǎo)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 內(nèi)生細菌；番茄；灰霉??；誘導(dǎo)抗性

中圖分類號 S476 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）11-03253-04

Abstract [Objective] To elucidate the mechanism of induced resistance of tomato to grey mold by endophytic bacterium TF28. [Method] the activity of defensive enzymes and the contents of defensive signals were determined. After the treatment with TF28， the activity of phenylalanine ammonialyase （PAL）， polyphenol oxidase （PPO）， peroxidase （POD）， lipoxygenase （LOX）， chitinase and β1，3glucanase increased significantly. [Result] The maximum of PAL， PPO， POD， LOX， chitinase and β1，3glucanase was 2.7， 2.5， 1.6， 1.5， 2.7 and 4.1times higher than that in control， respectively. The contents of salicylic acid （SA） and jasmonic acid （JA） were also improved significantly. The contents of SA reached the peak 7 days after inoculation while JA reached the maximum 3 days after treatment， which was 2.1 and 2.9 times higher than that in control， respectively. [Conclusion] Results demonstrated that endophytic bacterium TF28 could improve the activity of defensive enzymes to prevent Botrytis cinerea. The defense pathway might include SA and JA signal transmission.

Key words Endophytic bacterium； Tomato； Grey mould； Induced resistance

番茄灰霉病是番茄生產(chǎn)中的主要病害，嚴重影響番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。目前對于灰霉病的防治仍以化學(xué)農(nóng)藥為主，然而化學(xué)農(nóng)藥的毒性和殘留等問題日益突出，嚴重威脅人畜健康和環(huán)境安全。近年來利用拮抗細菌防治番茄灰霉病研究較多，主要側(cè)重于生防菌株篩選、防效、定殖以及抗菌物質(zhì)方面，所報道的菌株以芽孢桿菌為主，其生防機制主要包括營養(yǎng)和位點競爭、抗菌物質(zhì)的拮抗和誘導(dǎo)植物抗病性[2-8]。近年來，由于植物誘導(dǎo)抗病性具有廣譜性，被認為是植物病害防治新方式，因此對于芽孢桿菌誘導(dǎo)植物抗病性的研究日益增多[9-10]。研究表明，芽孢桿菌誘導(dǎo)植物抗病性因菌株而異，其誘導(dǎo)抗病性反應(yīng)的信號識別與傳導(dǎo)途徑、生理生化反應(yīng)模式等復(fù)雜多樣。植物防御酶系活性變化是生防細菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性的重要生理生化反應(yīng)，涉及的主要防御酶包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、幾丁質(zhì)酶（Chitinase）、β 1，3葡聚糖酶（β 1，3 Glucanase）和脂氧合酶（LOX）等，大量研究表明，植物受誘導(dǎo)因子刺激后這些酶活性增強[11]。水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）是植物抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的2個重要信號分子，其含量與植物抗病性成正相關(guān)[12]。

內(nèi)生細菌因與植物具有很好的親和性，成為近年來備受關(guān)注的一類重要生防菌株。內(nèi)生細菌TF28是筆者從大豆根部分離到的一株解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens，對大豆根腐病菌、水稻惡苗病菌、番茄灰霉病菌等10多種植物病原真菌具有很好的拮抗作用，能夠產(chǎn)生抗菌蛋白和脂肽類抗生素等多種抗菌物質(zhì)[13]。溫室試驗發(fā)現(xiàn)苗期噴灑TF28菌液能夠提高番茄抗灰霉病能力。筆者以苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、過氧化物酶、脂氧合酶、幾丁質(zhì)酶和β-1，3葡聚糖酶以及水楊酸和茉莉酸為指標，明確內(nèi)生細菌TF28處理后番茄葉片6種防御酶活性和2種抗病信號分子含量變化情況，為闡明內(nèi)生細菌TF28誘導(dǎo)番茄抗灰霉病機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

內(nèi)生細菌Bacillus amyloliquefaciens TF28分離自大豆根部，是一株具有廣譜抑菌作用的生防菌株。番茄灰霉病菌Botrytis cinerea分離自感病番茄果實。番茄品種為東農(nóng)713。

1.2 番茄灰霉病菌孢子懸浮液的制備

將活化后的番茄灰霉病菌菌絲塊接種至PDA平板，25 ℃培養(yǎng)7～10 d，用無菌水洗滌。洗滌液經(jīng)5 000 r/min 離心5 min后，棄沉淀，上清液用血球計數(shù)板計算孢子數(shù)，用無菌水稀釋至1.5×107cfu/ml的孢子懸液，添加0.02%吐溫80備用。

1.3 TF28菌液制備

挑取一環(huán)-70 ℃保存的TF28菌液劃線接種至NYD平板，30 ℃過夜培養(yǎng)，次日取單菌落轉(zhuǎn)接于5 ml NYD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)18 h，作為種子液。將種子液按2%接種量轉(zhuǎn)接于100 ml NYD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，活菌計數(shù)后用無菌水稀釋至2×108 cfu/ml的菌懸液備用。

1.4 盆栽試驗設(shè)計

挑選飽滿番茄種子，用清水浸泡5 h，催芽后播種，每盆1粒，保持適宜溫度、濕度和栽培管理，用第5片真葉作為研究對象，設(shè)4個處理，每個處理20株。①病菌處理：噴灑灰霉病菌孢子懸液；②內(nèi)生細菌處理：將TF28菌液添加0.02%吐溫80后噴施番茄葉片；③先接病菌后接內(nèi)生細菌處理：噴施番茄灰霉病菌孢子1d后再噴灑TF28菌液；④空白對照：只噴灑清水。處理后分別在1、2、3、4、5、6、7 d取各處理葉片測定防御酶活性和抗病分子含量。

1.5 防御酶活性測定

取0.2 g番茄葉片用于提取粗酶。苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）活性測定參照文獻[14]，幾丁質(zhì)酶（Chitinaes）和β1，3葡聚糖酶（β1，3glucanase）活性測定參照文獻[15]，脂氧合酶活性測定參照文獻[16]。

1.6 水楊酸和茉莉酸含量測定

取0.2 g番茄葉片，參照文獻[17]方法提取水楊酸，參照文獻[18]方法提取茉莉酸，用上海裕平生物科技有限公司的酶聯(lián)免疫試劑盒測定水楊酸和茉莉酸含量，按照說明書進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細菌TF28對番茄葉片PAL活性的影響

由圖1可知，內(nèi)生細菌TF28和灰霉病菌單獨以及共同處理后PAL活性顯著增強。3個處理酶活性變化規(guī)律相似，均在第2天活性最大，分別為對照的2.7、2.3和3.6倍，第7天活性最小，分別為對照的1.6、1.1和1.8倍。TF28和灰霉病菌共同處理PAL活性顯著高于兩者單獨處理，其最大活性比TF28和灰霉病菌單獨處理高29.3%和55.2%。TF28單獨處理PAL活性高于灰霉病菌單獨處理。表明內(nèi)生細菌TF28和灰霉病菌均能誘導(dǎo)番茄葉片PAL活性增強，TF28的誘導(dǎo)能力強于灰霉病菌，TF28和灰霉病菌共同誘導(dǎo)具有協(xié)同增效作用。

3 結(jié)論與討論

PAL、POD、PPO、LOX、Chitinase和β-1，3Glucanase是植物誘導(dǎo)抗病反應(yīng)中的主要防御酶，PAL、POD、PPO和LOX參與抗菌物質(zhì)植保素和木質(zhì)素合成，Chitinase和β-1，3Glucanase水解病原真菌細胞壁[19-20]，研究發(fā)現(xiàn)防御酶活性與植物誘導(dǎo)抗病性呈正相關(guān)性。薛玉瀟等[21]研究發(fā)現(xiàn)香蕉根部接種生防枯草芽孢桿菌后，香蕉葉片PAL、POD和PPO活性顯著提高；王淑霞等研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉Tr-92處理黃瓜根部，黃瓜葉片PAL、POD、PPO、Chitinase和β-1，3Glucanase活性顯著提高[22]。該研究用內(nèi)生細菌TF28噴灑番茄葉片后，番茄葉片PAL、POD、PPO、LOX、Chitinase和β-1，3Glucanase活性顯著提高，與已有報道一致，說明這些防御酶在內(nèi)生細菌誘導(dǎo)番茄抗灰霉病過程中起重要作用。6種防御酶活性變化規(guī)律和最高活性峰出現(xiàn)時間不同，PPO活性在接種后1 d立即達到最大，POD活性緩慢升高，在第7天達到最大，PAL活性在第2天達到最大，LOX、Chitinase和Glucanase活性均在第5天達到最大，這些酶活性高峰出現(xiàn)時間的異同可能與其在抗病反應(yīng)中所起作用早晚有關(guān)。在酶活性增加幅度上，除Chitinase之外，內(nèi)生細菌TF28處理后其他5種酶活性高于灰霉病菌單獨接種；內(nèi)生細菌與灰霉病菌共同處理PAL、PPO和Chitinase活性高于TF28單獨處理，POD、LOX和Glucanase活性與TF28單獨處理相當，說明先接種灰霉病菌可增強內(nèi)生細菌對番茄灰霉病誘導(dǎo)抗性。

PAL和LOX除參與抗菌物質(zhì)生成，還參與抗病信號分子合成，PAL參與SA合成，LOX參與JA合成[23]。內(nèi)生細菌TF28處理后， PAL活性和SA含量均提高，PAL活性在第2天最大，然后下降，SA含量在第3天最大；LOX活性在第2天活性較高，第5天活性最高，而JA含量在第3天最高，然后下降，推測噴灑內(nèi)生細菌1～3 d PAL主要參與SA合成，LOX主要參與JA合成，4～7 d兩者主要參與抗菌物質(zhì)合成。

植物體內(nèi)存在多條抗病信號傳導(dǎo)途徑，水楊酸和茉莉酸介導(dǎo)途徑是植物誘導(dǎo)抗病信號傳導(dǎo)2個主要途徑，不同誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)的植物抗病信號傳導(dǎo)途徑不同， 2種途徑存在拮抗和協(xié)同現(xiàn)象[24]。水楊酸和茉莉酸是植物抗病信號傳導(dǎo)途徑中的2個重要抗病信號分子，其含量與植物抗病性呈正相關(guān)。內(nèi)生細菌TF28誘導(dǎo)后番茄葉片中水楊酸和茉莉酸含量均升高，推測內(nèi)生細菌TF28誘導(dǎo)番茄抗灰霉病信號傳導(dǎo)途徑包括水楊酸和茉莉酸2種途徑，且2種途徑具有協(xié)同作用。

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