夏文睿等

摘要 [目的]了解MeCWINCV5在植物生長發(fā)育、激素調節(jié)和逆境脅迫應答中的功能。[方法]采用PCR方法從木薯基因組中分離MeCWINCV5基因啟動子序列，考察MeCWINCV5對植物生長發(fā)育、激素調節(jié)和逆境脅迫應答的影響。[結果]分析顯示啟動子的長度為1 170 bp，含有TATA box和CAAT box等多個典型的真核生物啟動子基本元件元件，還存在大量逆境脅迫誘導相關的順式調控元件，如HSE、MBS、SARE、GAREmotif和TATC-box等多個與植物逆境脅迫相關的元件。[結論]MeCWINCV5基因啟動子與逆境脅迫有關，在木薯抵御逆境脅迫的生理過程中具有重要作用。

關鍵詞 木薯；細胞壁酸性轉化酶；啟動子；逆境脅迫；順式調控元件

中圖分類號 S632 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）11-03179-03

Abstract [Objective] In order to study the promoter MeCWINCV5 in cassava which play important roles in plant growth and development，hormone regulations and stress responses.[Method] An 1 170 bp promoter region upstream of the MeCWINCV5 gene was isolated from cassava genomic DNA using PCR methods.[Result] Sequence analysis found that it contains a typical TATA box and CAAT box，and several cisacting elements that relate plant stress responses，such as HSE，MBS，SARE，GAREmotif，TATCbox transcription factor.[Conclusion] It is suggested that MeCWINCV5 gene may play important roles in response to various stresses.

Key words Cassava； Cell wall acid invertase； Promoter； Stress responsiveness； Cisacting element

木薯是全球最重要的糧食作物之一，但是塊根中積累的淀粉含量遠遠低于理論產量。蔗糖在淀粉積累過程中作為溝通源器官和庫器官的橋梁，而在源葉中合成的蔗糖從葉（源）到塊根（庫）的長途運輸過程主要由蔗糖轉化酶（INV）來調控完成[1-3]。蔗糖轉化酶根據其最適pH值分為中性轉化酶 （neutral invertase，NI）和酸性轉化酶 （acid invertase，AI）[4]。細胞壁酸性轉化酶催化蔗糖的分解是韌皮部卸載的關鍵步驟[5]。在庫器官中提高細胞壁酸性轉化酶的活性有利于蔗糖在庫器官中的積累，也是植物源庫器官蔗糖代謝的關鍵酶[6]。研究者通過研究木薯細胞壁酸性轉化酶基因啟動子上的生長激素相關元件和逆境相關反應元件與啟動子的相互作用來探討木薯細胞壁酸性轉化酶基因啟動子對轉化酶基因的調控作用[7]。筆者采用PCR方法從木薯基因組中分離MeCWINCV5基因啟動子序列，考察MeCWINCV5對植物生長發(fā)育、激素調節(jié)和逆境脅迫應答的影響，以期為MeCWINCV5的合理開發(fā)利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 華南木薯8號，由實驗室采購。

1.2 方法

1.2.1 華南木梳8號基因組DNA的提?。–TAB 法）[8]。取 1.000 g經暗培養(yǎng) 2～3 d的幼嫩木薯葉片（去葉脈），經液氮研磨后加入預熱至65 ℃的CTAB提取緩沖液中提取，上清液加等體積氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）混勻后離心；上清液用等體積苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V/V）和氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）反復抽提。加入1/10體積NaAc（3 mol/L，pH5.2）和2倍體積冷乙醇以沉淀 DNA（2 h），分別用70%、80%乙醇洗滌沉淀并加入100 μl TE緩沖液回溶DNA沉淀，同時加入2 μl RNase，置37 ℃處理2 h。再用等體積的苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V/V）和氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）分別抽提，吸取上清液，重新沉淀DNA，用濃度70%乙醇，清洗風干，加入適量體積的去離子水回溶。

1.2.2 木薯細胞壁酸性轉化酶MeCWINCV5基因啟動子。根據課題組已經克隆得到的木薯細胞壁酸性轉化酶基因MCWINV5序列（GeneBank：X291159）和phytozome植物基因序列預測庫的木薯MCWINV5基因序列，設計引物如下，CW5F：5ATGAGCTCTAATGCAGTCCGAC

AC3和CW5R： 5GTGGATCCGATCGAAGAAAAAAG3，PCR反應條件：94 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，56 ℃退火延伸150 s，共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

1.2.3 生物信息學分析。將測序得到的片段序列與MeCWINCV5基因的序列比對，確定擴增的啟動子序列的正確性。利用PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）和PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線軟件分析啟動子序列，預測順式作用元件位點[9]。

2 結果與分析

2.1 啟動子片段的擴增與克隆 根據已經克隆得到的木薯細胞壁轉化酶基因MeCWINV5（GeneBank：X291159）序列和phytozome植物基因序列預測庫的木薯MeCWINV5基因序列設計引無為CW5F：5ATGAGCTCTAATGCAGTCCGACAC3和CW5R：5GTGGATCCGA TCGAAGAAAAAAG3，從華南8號木薯組培苗中擴增得到一段長為1 300 bp的序列，命名為cw5（圖1）。將片段與pMD19T進行連接，通過菌液PCR，篩選獲得陽性單克隆測序后，將其與MeCWINV5基因CDs區(qū)序列和phytozome植物基因序列預測庫中相應序列進行比對，結果發(fā)現(xiàn)此片段含有MeCWINV2基因從ATG起始的長為130 bp的CDs序列和ATG上游長為1 170 bp的潛在啟動子序列（圖2）。

3 結論與討論

試驗采用PCR的方法對華南木薯8號MeCWINV5基因啟動子進行了克隆，得到一段長為1 170 bp的啟動子序列，對該片段序列進行分析，發(fā)現(xiàn)此片段上含有CAAT box和TATA box等多個典型的真核生物啟動子元件，并且含有熱脅迫響應的答元件HSE，干旱誘導相關元件MBS，水楊酸響應元件SARE，赤霉素反應元件GAREmotif、TATCbox和脅迫防御元件TCrich repeats等多個順式作用元件。在擬南芥[10]，煙草[11]，大豆[12]等植物轉化酶基因啟動子已驗證上述激素調控和脅迫，由此可以看出MeCWINV5可能參與多種信號傳播，并且在木薯逆境脅迫應答中起到了重要作用。由于細胞壁轉化酶MeCWINV5基因在植物生命活動中和逆境脅迫起到越來越重要的作用，而被人們所關注，近年來關于細胞壁轉化酶基因的研究有了一定的進展，但是大部分停留在對啟動子的克隆以及序列分析階段，其作用機制依然空缺，啟動子在基因上游部分，調控基因的表達，預測基因的功能，如果能進一步對啟動子序列進行研究，就可以為研究基因功能和啟動子作用元件分析提供方向和依據。

參考文獻

[1]

李開綿，林雄，黃潔.國內外木薯科研發(fā)展概況[J].熱帶農業(yè)科學，2001，1（2）：56-60.

[2] 陸飛伍，羅興錄，李紅雨，等.不同木薯品種葉片碳氮代謝與塊根淀粉積累特性研究[J].中國農學通報，2009，25（10）：120-124.

[3] 池敏青.木薯塊根淀粉積累過程生理生化特性研究[D].南寧：廣西大學，2007：32-53.

[4] 潘秋紅，張大鵬.植物轉化酶的種類、特性與功能[J].植物生理學通訊，2004，40（3）：275-280.

[5] 盧合全，沈法富，劉凌霄，等.植物蔗糖合成酶功能與分子生物學研究進展[J].中國農學通報，2005，21（7）：34-37.

[6] 劉永忠，李道高.柑橘果實糖積累與蔗糖代謝酶活性的研究[J].園藝學，2003，30（4）：457-459.

[7] 潘秋紅，張大鵬.植物酸性轉化酶基因及其表達調控[J].植物學通報，2005，22（2）：129-137.

[8]

AN Z W，WANG Q T，HU Y S，et al.Coextraction of highquality RNA and DNA from rubber tree（Hevea brasiliensis）[J].Afr J Biotechnol，2012，11 ：9308-9314.

[9] HIGO K，UGAWA Y，IWAMOTO M，et al.Plant cisacting regulatory DNA elements（PLACE）database ：1999 Nucleic[J].Acids Res，1999，27（1）：297-300.

[10] FUJIMOTO S Y，OHTA M，USUI A，et al.Arabidopsis ethylene responsive element binding factors act as transcriptional activators or repressors of GCC box mediated gene expression[J].The Plant Cell，2000，12（3）：393-404.

[11]劉文奇，陳旭君，徐曉輝，等.ERF 類轉錄因子OPBP1 基因的超標達提高煙草的耐鹽能力[J].植物生理與分子生物學學報，2002，28（6）：473-478.

[12] ZHANG G Y，CHEN M，LI L C.Overexpression of the soybean GmERF3 gene，an AP2/ERF type transcription factor forincreased tolerances to salt，drought，and diseases in transgenic tobacco[J].Journal of Experimental Botany，2009，60（13）：3781-3796.