寧效斌 蘇雷
摘要 綜述了幾種與哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育分子調(diào)控相關(guān)的重要蛋白質(zhì)以及超低溫冷凍保存在分子水平上對(duì)胚胎發(fā)育的影響。
關(guān)鍵詞 哺乳動(dòng)物;冷凍;胚胎發(fā)育;分子調(diào)控
中圖分類(lèi)號(hào) S813.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611(2014)13-03926-04
Abstract Several essential kinds of proteins related to the molecular regulation of mammalian embryonic development were reviewed, as well as effects of cryopreservation on embryonic development at the molecular level.
Key words Mammalian; Cryopreservation; Embryonic development; Molecular regulation
近年來(lái),由于胚胎冷凍技術(shù)的不斷進(jìn)步,已成為一項(xiàng)成熟的胚胎工程技術(shù),甚至克隆胚胎通過(guò)冷凍技術(shù)也獲得了相應(yīng)的后代[1]。盡管如此,胚胎冷凍的機(jī)理尚不十分清楚。除了冷凍保護(hù)劑的毒性、冷凍損傷、細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成等因素對(duì)胚胎產(chǎn)生影響外,冷凍本身可使胚胎內(nèi)的一些固有結(jié)構(gòu)、物質(zhì)(如mRNA)發(fā)生改變[2],嚴(yán)重影響胚胎的存活率。冷凍/解凍后胚胎的基因表達(dá)分析可能是一種有效揭示這類(lèi)胚胎早期發(fā)育分子機(jī)制的有效途徑。
1 哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中相關(guān)的重要蛋白質(zhì)
在哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育過(guò)程中,細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的變化錯(cuò)綜復(fù)雜。早期胚胎的發(fā)育是由卵母細(xì)胞中的一些因子來(lái)調(diào)控的,這些因子是在卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中合成和存儲(chǔ)的。在胚胎基因組活性激活以前,胚胎的發(fā)育是由這些因子來(lái)調(diào)節(jié)的。胚胎形成后,基因組的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)才被啟動(dòng),胚胎的發(fā)育逐漸由自身合成的物質(zhì)來(lái)調(diào)控。
1.1 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase)
目前,在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)4種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmts),根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的差異分為兩大類(lèi):分別以Dnmt1和Dnmt3為代表。前者主要用于保持子代細(xì)胞與母細(xì)胞相同的DNA特異性甲基化模式,參與甲基化狀態(tài)的維持,也是非CpG位點(diǎn)從頭甲基化所必需的,并與甲基化狀態(tài)的延伸有關(guān);后者包括Dnmt3a、Dnmt3b以及Dnmt3L等,主要負(fù)責(zé)建立胚胎發(fā)育分化過(guò)程中的組織特異性甲基化模式,是主要的從頭甲基化酶[3]。Dnmt對(duì)早期胚胎的正常發(fā)育至關(guān)重要[4-5]。
在不同的序列類(lèi)別中,哺乳動(dòng)物的DNA甲基化對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄活性是一種主要和關(guān)鍵的表觀遺傳調(diào)節(jié)機(jī)制(Epigenetic regulatory mechanism)。在小鼠的生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中,從頭甲基化只在非常有限的時(shí)期發(fā)生,說(shuō)明Dnmt3a和Dnmt3b在限制功能的表達(dá)有一定的機(jī)制作用[6]。分析Dnmt3a還能確定表觀遺傳重編程(Epigenetic reprogramming)的潛能差異[7]。Dnmtl蛋白在胚胎發(fā)育時(shí)建立組織特異性甲基化模式方面發(fā)揮重要作用,在正常發(fā)育的胚胎中維持一種正確的DNA甲基化模式需要Dnmt1地正確表達(dá)和發(fā)育階段特定的翻譯后調(diào)節(jié)[8]。在綿羊的生發(fā)泡(Germinal vesicle,GV)期卵母細(xì)胞及早期胚胎發(fā)育過(guò)程中,GV期卵中Dnmt1 mRNA含量最高,從2-細(xì)胞胚胎開(kāi)始直至囊胚,Dnmt1基因的mRNA含量顯著降低,Dnmt1的含量在不同發(fā)育階段的卵母細(xì)胞和胚胎中存在動(dòng)態(tài)變化,這對(duì)卵子生長(zhǎng)和胚胎發(fā)育具有重要意義[9]。
1.2 縫隙連接蛋白(Connexins)
此類(lèi)蛋白是細(xì)胞間建立縫隙連接所必需的。在研究胚胎致密化的分子調(diào)控時(shí)發(fā)現(xiàn),牛體內(nèi)胚胎在桑椹胚期可檢測(cè)到connexin43(Cx43)的表達(dá)[10],體外生產(chǎn)的牛胚胎有的不表達(dá)這類(lèi)蛋白,導(dǎo)致胚胎不能致密化,無(wú)法形成桑椹胚[11],從而降低胚胎潛能性。在綿羊卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育過(guò)程中,connexin26、connexin32、Connexin43及Connexin45在各個(gè)時(shí)期均有表達(dá),Cx43在未成熟卵母細(xì)胞、體外成熟(IVM)卵母細(xì)胞、2-細(xì)胞中表達(dá)量較低,??芭吆湍遗咂跁r(shí)達(dá)到最高;而Cx45在8-細(xì)胞期表達(dá)量最高,未成熟卵母細(xì)胞、IVM卵母細(xì)胞和2-細(xì)胞期的表達(dá)量低于8-細(xì)胞期,桑堪胚和囊胚期胚胎的表達(dá)量稍低于8-細(xì)胞期;Cx43和Cx45蛋白在體內(nèi)受精胚胎中轉(zhuǎn)錄子的含量高于體外受精(IVF)胚胎[12]。Cx43基因在水牛IVM卵母細(xì)胞中表達(dá)量最高,顯著高于IVF 2-細(xì)胞期胚胎、桑椹期胚胎、囊胚期胚胎[13]。
1.3 上皮鈣調(diào)素蛋白(Epithelial cadherin,E-cadherin)
調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞間粘連的重要蛋白,其功能的發(fā)揮需要Ca2+的參與。在研究胚胎致密化及細(xì)胞間連接的分子調(diào)控時(shí)發(fā)現(xiàn),E-cadherin是桑椹胚外層細(xì)胞或囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞間緊密連接復(fù)合體形成的主導(dǎo)因子,胚胎致密化或囊胚的形成主要依賴于此蛋白。如果這種蛋白質(zhì)缺失或其功能達(dá)不到正常發(fā)揮,胚胎在桑椹胚或囊胚期的發(fā)育就會(huì)出現(xiàn)異常[14],導(dǎo)致胚胎不能進(jìn)入下一發(fā)育階段。在水牛IVM卵母細(xì)胞及IVF早期胚胎發(fā)育過(guò)程中,E-cad基因在各個(gè)時(shí)期中mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異[13]。
1.4 緊密連接蛋白(Tight junction protein)
研究表明外層細(xì)胞間的緊密連接至少是由5種蛋白構(gòu)成的復(fù)合體,它們分別是ZO-1、ZO-2、7H6、扣帶蛋白和封閉蛋白。封閉蛋白是核心成員之一,它與ZO-1和扣帶蛋白結(jié)合在一起構(gòu)成細(xì)胞外連接和細(xì)胞內(nèi)骨架間的結(jié)合鏈,使胚胎內(nèi)細(xì)胞之間緊密連接起來(lái)。ZO-1是構(gòu)成細(xì)胞間連接的主要成分,在小鼠和牛胚胎外層細(xì)胞的連接部位,呈點(diǎn)狀分布[14]。外層細(xì)胞的緊密連接在胚胎發(fā)育過(guò)程中具有重要功能:調(diào)節(jié)相鄰細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸;維持外層細(xì)胞的極性;維持Na/K-ATP酶的極性分布;維持半透膜的穩(wěn)定性,防止過(guò)度膨脹[15]。
1.5 干擾素-τ(Interferonτ,IFN-τ)
IFN-τ是一種孕體分泌蛋白,在反芻動(dòng)物的整個(gè)妊娠失敗中早期胚胎死亡占有很大的比例,它在很大程度上是由母體妊娠識(shí)別失敗造成的。IFN-τ是由反芻動(dòng)物孕體附植時(shí)發(fā)出的特有的妊娠識(shí)別信號(hào),是建立母體妊娠識(shí)別的一種主要因子。另外,IFN-τ在免疫方面也起著重要作用。
牛胚胎在體外生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,IFN-τ在胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá),除在未成熟卵母細(xì)胞中呈高表達(dá)外,其余都呈低表達(dá),這與其維持黃體功能密切相關(guān)[16]。Rho G J等也研究表明IFN-τ在胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)[17]。然而,也有研究表明IFN-τ mRNA在牛IVF第4天的16-細(xì)胞胚胎期、體細(xì)胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)第5天的桑椹期、孤雌激活(Parthenogenetic activation,PA)第6天的早期囊胚期首次表達(dá)[18]。
1.6 熱休克蛋白(Heat shock proteins)
哺乳動(dòng)物中廣泛存在一類(lèi)熱應(yīng)急蛋白質(zhì)。當(dāng)有機(jī)體暴露于高溫時(shí),就會(huì)由熱激發(fā)合成此種蛋白,來(lái)保護(hù)有機(jī)體自身。許多熱休克蛋白具有分子伴侶活性。按照蛋白的大小,熱休克蛋白共分為5類(lèi),分別為Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60 以及小分子熱休克蛋白(Small heat shock proteins,sHSPs)。
在牛胚胎體外生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,Hsp70在胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá),但表達(dá)量稍低[16]。1999年C.WRENZYCKI等在對(duì)牛體外胚胎進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),發(fā)現(xiàn)添加血清的培養(yǎng)液獲得的早期胚胎比添加聚乙烯醇(PVA)的培養(yǎng)液獲得的早期胚胎的潛能性更高,差異顯著,同時(shí),在2個(gè)試驗(yàn)組中均發(fā)現(xiàn)Hsp70持續(xù)表達(dá),且添加血清的比添加PVA的試驗(yàn)組顯著增加[19],表明Hsp70的表達(dá)量與體外生產(chǎn)的胚胎質(zhì)量成正相關(guān)。Mishra A等研究也發(fā)現(xiàn)Hsp70在胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá),但在發(fā)育緩慢的胚胎中Hsp70的表達(dá)量較少,8-16細(xì)胞期后幾乎不表達(dá);它與溫度緊密相關(guān),隨著溫度的增加,Hsp70 mRNA的表達(dá)量也相應(yīng)提高,說(shuō)明Hsp70 mRNA的表達(dá)可能作為胚胎對(duì)溫度敏感性的靶標(biāo)[20]。
1.7 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Glucose transporters)
此類(lèi)蛋白與細(xì)胞代謝有關(guān)。2002年Knijn等研究表明牛體內(nèi)受精獲得的囊胚期胚胎
Glut-1表達(dá)量顯著高于體外獲得的囊胚期胚胎[21]。在牛胚胎體外生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,Glut-1基因一直持續(xù)高表達(dá),這與體外培養(yǎng)的胚胎生長(zhǎng)發(fā)育狀況密切相關(guān)[16]。
Rajhans R等研究也發(fā)現(xiàn)Glut-1在水牛體外生產(chǎn)胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá),但在發(fā)育緩慢的胚胎中Glut-1的表達(dá)量較少,8-16細(xì)胞期后幾乎不表達(dá),說(shuō)明Glut-1的表達(dá)與胚胎發(fā)育阻滯密切相關(guān)[22]。2010年J. Zaraza等研究表明Glut-3在8-細(xì)胞、16-細(xì)胞時(shí)期表達(dá)水平低,囊胚期表達(dá)量增加,說(shuō)明葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)囊胚期胚胎是非常必需的[23]。哺乳動(dòng)物附植前胚胎能輕易地吸收及利用葡萄糖,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮了很大作用。另外,有研究發(fā)現(xiàn)Glut1、Glut3、Glut8在胚胎發(fā)育早期各個(gè)時(shí)期均有表達(dá),而Glut2僅在囊胚期開(kāi)始表達(dá)[24]。
1.8 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白
細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象,在多細(xì)胞生物去除不需要的或異常的細(xì)胞中起著必要的作用。細(xì)胞凋亡是個(gè)體發(fā)育過(guò)程中由一系列蛋白調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程。其中,bcl-2家族、caspase家族、p53蛋白、survivin蛋白都是重要的凋亡調(diào)節(jié)因子,在細(xì)胞凋亡中相互聯(lián)系,相互作用,從而調(diào)控細(xì)胞凋亡。
研究發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖可誘導(dǎo)小鼠囊胚細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3的表達(dá),其表達(dá)在內(nèi)細(xì)胞群尤其明顯,并伴有囊胚細(xì)胞數(shù)目明顯減少,從而證實(shí)高濃度葡萄糖對(duì)胚胎的毒性作用在胚胎著床前已經(jīng)發(fā)生[25]。Bcl-2基因通過(guò)阻止抑制細(xì)胞凋亡直接調(diào)控正常免疫器官的發(fā)育, 在淋巴細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中Bcl-2是免疫細(xì)胞亞型選擇的重要調(diào)節(jié)物[26]。在小鼠體內(nèi)早期胚胎發(fā)育過(guò)程中,隨著胚胎細(xì)胞數(shù)目的增加,凋亡比率逐漸增大;Bax表達(dá)量在整個(gè)過(guò)程中基本不變,Bcl-2表達(dá)量逐漸上調(diào),Bak、Bcl-xl的表達(dá)量逐漸降低[27]。2008年H.Y.Jang等用牛輸卵管上皮細(xì)胞(BOEC)與胚胎共培養(yǎng)時(shí),發(fā)現(xiàn)不管是共培養(yǎng)獲得的早期胚胎還是單獨(dú)培養(yǎng)得到的早期胚胎,均檢測(cè)到Caspase-3和Bax基因,然而p53基因只在與BOEC共培養(yǎng)的胚胎中被檢測(cè)到[28]。2006年Boon Chin Heng等研究表明細(xì)胞凋亡而不是細(xì)胞壞死是降低冷凍/解凍后的人類(lèi)胚胎干細(xì)胞(hES)生存能力的主要機(jī)制,此hES是用傳統(tǒng)冷凍法冷凍保存的[29]。
2 超低溫冷凍對(duì)胚胎的分子調(diào)控研究現(xiàn)狀
2007年Dhali等采用微滴玻璃化冷凍法(Droplet vitrification)冷凍小鼠囊胚期胚胎時(shí),發(fā)現(xiàn)冷凍后的胚胎與鮮胚相比,Bax、Bcl-2和p53 3個(gè)基因轉(zhuǎn)錄物相對(duì)量均下降,同時(shí)凍胚的發(fā)育潛能力比鮮胚低,表明此3種基因轉(zhuǎn)錄物與胚胎發(fā)育潛力有很大的聯(lián)系[30]。然而,2010年Kuzmany等研究牛胚胎的冷凍時(shí)發(fā)現(xiàn),與冷凍前的胚胎相比,冷凍后胚胎中的Bax及Bcl-XL轉(zhuǎn)錄物相對(duì)量均顯著增加,說(shuō)明超低溫冷凍對(duì)胚胎內(nèi)細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄物同樣有影響[31]。2011年Anna Kuzmany等也發(fā)現(xiàn),與體外培養(yǎng)獲得的牛鮮胚相比,冷凍后囊胚中的Bax、Bcl-XL基因表達(dá)顯著上調(diào)(Up-regulation),結(jié)果表明冷凍后的胚胎已經(jīng)開(kāi)啟mRNA合成,為下一步胚胎發(fā)育做準(zhǔn)備[32]。2012年Lisa Shaw等研究超低溫冷凍對(duì)人早期胚胎的基因表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn),與鮮胚相比,冷凍組的4-細(xì)胞胚胎與囊胚Bax表達(dá)顯著上調(diào)[33]。
2006年Sae Young Park等用2種不同玻璃化冷凍法(0.25 ml麥管開(kāi)放式拉管法和最小容積法)對(duì)牛囊胚進(jìn)行冷凍試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)survivin、Fas、caspase-3及Hsp70的表達(dá)水平較非冷凍組顯著增加,表明冷凍程序可能導(dǎo)致胚胎損傷,從而引起DNA破裂且細(xì)胞凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄物也隨之增加,最終降低了冷凍胚胎的發(fā)育潛能[34]。2010年Kuzmany等研究也表明,與冷凍前相比,冷凍后擴(kuò)張囊胚(Reexpanded blastocysts)中的HSPA1A mRNA顯著增加[31];與牛IVP正常胚胎相比,玻璃化法和傳統(tǒng)冷凍法使孵化囊胚中的HSP70轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)量受到明顯影響,揭示不同冷凍方法對(duì)牛孵化囊胚中的重要基因表達(dá)量具有很大影響[35]。 2011年Stinshoff等用傳統(tǒng)冷凍法與玻璃化冷凍法對(duì)牛擴(kuò)張囊胚期胚胎進(jìn)行冷凍保存時(shí),發(fā)現(xiàn)用玻璃化法的HSPA1A與鮮胚組存在顯著差異,用傳統(tǒng)冷凍法的HSPA1A與鮮胚組相比也存在顯著差異,而玻璃化法(Vitrification)比傳統(tǒng)冷凍法(Conventional slow freezing)更適合于保存胚胎[36]。2011年Anna Kuzmany等研究時(shí)發(fā)現(xiàn),與體外培養(yǎng)獲得的牛囊胚期鮮胚相比,冷凍后的囊胚中Hsp 1A的轉(zhuǎn)錄物顯著地上調(diào)[32]。
與 IVP 的正常牛孵化囊胚相比,用玻璃化法和傳統(tǒng)冷凍法冷凍后的孵化囊胚中GLUT-1轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)量受到明顯影響,用傳統(tǒng)冷凍法冷凍后的孵化囊胚中的GLUT-3 mRNA量也受到顯著影響,結(jié)果表明冷凍處理過(guò)程本身及冷凍方法對(duì)牛孵化囊胚中的重要基因的表達(dá)有很大影響[35]。2011年Stinshoff等發(fā)現(xiàn)用玻璃化法冷凍后的擴(kuò)張囊胚中Glut-1表達(dá)豐度與鮮胚存在顯著差異,用傳統(tǒng)冷凍法冷凍后的Glut-1、 Glut-3與鮮胚組也存在顯著差異,揭示玻璃化法比傳統(tǒng)冷凍法更適合于保存胚胎[36]。
在研究胚胎致密化及細(xì)胞間連接的分子調(diào)控時(shí)發(fā)現(xiàn),與 IVP 正常牛孵化囊胚相比,用玻璃化法和傳統(tǒng)冷凍法冷凍后的孵化囊胚中ZO-1轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)量明顯受到影響,同時(shí)發(fā)育潛能也降低[35]。與正常鮮胚相比,傳統(tǒng)冷凍法冷凍后的孵化囊胚中DNMT3a mRNA量受到顯著影響[35]。2011年Stinshoff等發(fā)現(xiàn)用傳統(tǒng)冷凍法冷凍后的胚胎中DNMT3a mRNA相對(duì)豐度與鮮胚組相比也存在顯著差異[36]。對(duì)干擾素的研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)冷凍法冷凍后的牛孵化囊胚中的IFN-τ mRNA量受到顯著影響[35]。2011年Stinshoff等也發(fā)現(xiàn)用傳統(tǒng)冷凍法冷凍后的牛胚胎IFN-τ mRNA量與鮮胚對(duì)照組存在顯著差異,此外玻璃化法與傳統(tǒng)冷凍法相比IFNT2基因轉(zhuǎn)錄物也存在顯著差異[36]。
3 小結(jié)
綜上所述,超低溫冷凍保存對(duì)哺乳動(dòng)物體外生產(chǎn)胚胎質(zhì)量的影響在分子水平上清楚地得到反映。在胚胎冷凍過(guò)程中,研究表明盡可能保證及維持早期胚胎基因組的正常表達(dá),凍融胚胎的潛能性就可以得到提高,從而可以依此判斷冷凍方法的可行性及高效性。從分子水平上來(lái)分析胚胎的質(zhì)量,可為拯救瀕危動(dòng)物和開(kāi)發(fā)利用珍稀動(dòng)物及解決基因克隆的低效率問(wèn)題提供技術(shù)參考。隨著分子檢測(cè)技術(shù)的不斷提高,胚胎質(zhì)量的鑒定也會(huì)更加方便準(zhǔn)確,胚胎冷凍損傷機(jī)制也將得到進(jìn)一步闡釋。
參考文獻(xiàn)
[1] WILMUT I,SCHNIEKE A E,MCWHIR J,et al.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells[J].Nature,1997,385:810-813.
[2] HA A N,LEE S R,JEON J S,et al.Development of a modified straw method for vitrification of in vitroproduced bovine blastocysts and various genes expression in between the methods[J].Cryobiology,2014,68(1):57-64.
[3] GIRALDO A M,DECOURCY K,BALL S F,et al.Gene Expression of Dnmt1 Isoforms in Porcine Oocytes,Embryos,and Somatic Cells[J].Cellular Reprogramming,2013,15(4):309-321.
[4] ODOHERTY A M,OSHEA L C,F(xiàn)AIR T.Bovine DNA methylation imprints are established in an oocyte sizespecific manner,which are coordinated with the expression of the DNMT3 family proteins[J].Biology of Reproduction,2012,86(3):1-10.
[5] DOBBS K B,RODRIGUEZ M,SUDANO M J,et al.Dynamics of DNA methylation during early development of the preimplantation bovine embryo[J].PLoS One,2013,8(6):1-10.
[6] XU G L,BOURCHIS D,HSIEH C L,et al.Chromosome instability an immunodeficiency syndrome caused by mutations in a DNA methyltransferase gene[J].NATURE,1999,402(6758):187-191.
[7] OKANO M,BELL D W,HABER D A,et al.DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian[J].CELL,1999,99(3):247-257.
[8] CHUNG Y G,RATNAM S,CHAILLET J R,et al.Abnormal regulation of DNA methyltransferase expression in cloned mouse embryos[J].Biology Reproduction,2003,69(1):146-153.
[9] 侯敏,林嘉鵬,白潔,等.母源基因Gdf9、Zar1、Mater和Dnmt1 mRNA在綿羊卵母細(xì)胞和早期胚胎中的表達(dá)[J].中國(guó)草食動(dòng)物,2010,30(2):5-10.
[10] WRENZYCKI C,HERRMANN D,CARNWATH J W,et al.Expression of RNA from developmentally important genes in preimplantation bovine embryos produced in ICM supplemented with BSA[J].Journal of Reproduction and Fertility,1998,112(2):387-398.
[11] NIEMANN H,WRENZYCKI C.Alterations of expression of developmentally important genes in preimplantation bovine embryos by in vitro culture conditions:implications for subsequent development[J].Theriogenology,2000,53(1):21-34.
[12] 閆真.間隙連接蛋白在綿羊早期胚胎中的表達(dá)和作用研究[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古大學(xué),2009.
[13] 黃時(shí)海,孫洪亮,康超,等.水牛體外培養(yǎng)早期胚胎中致密化相關(guān)基因mRNA的表達(dá)分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2010,37(6):43-46.
[14] 桑潤(rùn)滋.動(dòng)物繁殖生物技術(shù)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2006.
[15] WATSON A J.The cell biology of blastocyst development[J].Molecular Reproduction and Development,1992,33(4):492-504.
[16] 孫美玉,陳靜波,毋狀元,等.牛胚胎發(fā)育早期MnSOD,Glut-1,Hsp70,IGF-Ⅱ,IFN-τ基因表達(dá)差異的研究[J].草食家畜,2011(1):39-43.
[17] RHO G J,KIM D S,SON W J,et al.Influence of in vitro oxygen concentrations on preimplantation embryo development,gene expression and production of Hanwoo calves following embryo transfer[J].MoI Reprod Dev,2007,74(4):486-496.
[18] YAO N,WAN P C,HAO Z D,et al.Expression of interferontau mRNA in bovine embryos derived from different procedures[J].Reproduction in Domestic Animals,2009,44(1):132-139.
[19] WRENZYCKI C,HERRMANN D,CARNWATH J W,et al.Alterations in the relative abundance of gene transcripts in preimplantation bovine embryos cultured in medium supplemented with either serum or PVA[J].Molecular Reproduction and Development,1999,53(1):8-18.
[20] LI Q,HAN J,DU F,et al.Novel SNPs in HSP70AlA gene and the association of polymorphisms with thermo tolerance traits and tissue specific expression in Chinese Holstein cattle[J].Molecular Biology Reports,2011,38(1):2657-2663.
[21] KNIJN H M,WRENZYCKI C,HENDRIKSEN P J M,et al.Effects of oocyte maturation regimen on the relative abundance of gene transcripts in bovine blastocysts derived in vitro or in vivo[J].Reproduction,2002,124(3):365-375.
[22] RAJHANS R,KUMAR G S,DUBEY P K,et al.Effect of timing of development on total cell number and expression profile of HSP -70.1 and GLUT-1 in buffalo (Bubalus bubalis) oocytes and preimplantation embryos produced in vitro[J].Cell Biology International,2010,34(5):463-468.
[23] ZARAZA J,OROPEZA A,VELAZQUEZ M A,et al.Developmental competence and mRNA expression of preimplantation in vitroproduced embryos from prepubertal and postpubertal cattle and their relationship with apoptosis after intraovarian administration of IGF-1[J].Theriogenology,2010,74(1):75-89.
[24] AUGUSTIN R,POCAR P,NAVARRETESANTOS A,et al.Glucose transporter expression is developmentally regulated in in vitro derived bovine preimplantation embryos[J].Molecular Reproduction and Development,2001,60(3):370-376.
[25] 尹芳,張端蓮,熊彥娥,等.高糖誘導(dǎo)小鼠囊胚Caspase-3的表達(dá)及其意義[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2005,14(5):544-546.
[26] 張書(shū)霞,陳萬(wàn)芳,于勇,等.bcl-2基因在成年和胚胎雞免疫器官中的表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1999,22(4):65-68.
[27] 李威,王連卿,蘇靜艷,等.小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞凋亡及凋亡基因表達(dá)的檢測(cè)[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志,2006,28(4):596-602.
[28] JANG H Y,JUNG Y S,CHEONG H T,et al.Effects of cell status of bovine oviduct epithelial cell (BOEC) on the development of bovine IVM/IVF embryos and gene expression in the BOEC used or not used for the embryo culture[J].AsianAust J Anim Sci,2008,21(7);980-987.
[29] HENG B C,YE C P,LIU H,et al.Loss of viability during freezethaw of intact and adherent human embryonic stem cells with conventional slowcooling protocols is predominantly due to apoptosis rather than cellular necrosis[J].Journal of Biomedical Science,2006,13(3):433-445.
[30] DHALI A,ANCHAMPARUTHY V M,BUTLER S P,et al.Gene expression and development of mouse zygotes following droplet vitrification[J].Theriogenology,2007,68(9):1292-1298.
[31] KUZMANY A,HAVLICEK V,WRENZYCKI C,et al.Effect of culture method on the mRNA expression before and after cryopreservation in bovine blastocysts[J].Reproduction,F(xiàn)ertility and Development,2010,23(1):143-144.
[32] KUZMANY A,HAVLICEK V,WRENZYCKI C,et al.Expression of mRNA,before and after freezing,in bovine blastocysts cultured under different conditions[J].Theriogenology,2011,75(3):482-494.
[33] SHAW L,SNEDDON S F,BRISON D R,et al.Comparison of gene expression in fresh and frozen-thawed human preimplantation embryos[J].Reproduction,2012,144(5):569-582.
[34] PARK S Y,KIM E Y,CUI X S,et al.Increase in DNA fragmentation and apoptosisrelated gene expression in frozenthawed bovine blastocysts[J].Zygote,2006,14(2):125-131.
[35] STINSHOFF H,BRNING K,HANSTEDT A,et al.Effect of different cryopreservation methods on the quality of in vitroproduced bovine embryos[J].Reproduction,F(xiàn)ertility and Development,2010,22(1):217.
[36] STINSHOFF H,WILKENING S,HANSTEDT A,et al.Cryopreservation affects the quality of in vitro produced bovine embryos at the molecular level[J].Theriogenology,2011,76:1433-1441.