呂全等

摘要 [目的]分離克隆馬尾松α蒎烯合成酶基因cDNA全長。[方法]根據(jù)其他松科植物α蒎烯合成酶基因保守區(qū)域設計引物，擴增出基因的部分片段，再結合RACE技術分別擴增出基因3端和5端序列，通過序列拼接獲得cDNA全長，結合生物信息學軟件分析該基因編碼蛋白的特性。[結果]馬尾松α蒎烯合成酶基因cDNA全長為2 103 bp，編碼區(qū)1 980 bp，編碼629個氨基酸，含有1個N端結構域、1個金屬結合結構域和1個天冬氨酸富集基序（DDMYD）。[結論]該方法成功克隆了馬尾松α蒎烯合成酶基因cDNA全長序列，具有單萜烯合成酶基因的典型特征，序列提交至GenBank，獲得登錄號KF547035。

關鍵詞 馬尾松（Pinus massoniana）；蒎烯合成酶基因；RACE

中圖分類號 S791.248 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）13-03808-04

Abstract [Objective] To clone the fulllength of αpinene synthase gene from Pinus massoniana. [Method] According to high conservative amino acids of reported αpinene synthase gene from pinaceaes， a pair of degenerate primers was designed and partial fragment was obtained by PCR amplification. Based on this known sequence， some new primers were designed， two terminals gene sequence were cloned by 3 RACE and 5 RACE respectively. After splicing the fragments of sequence， analyzed the structures and function of the coded protein by bioinformatics softwares. [Result] The fulllength cDNA of αpinene synthase gene consists of 2 103 bp， contains a 1 890 bp open reading frame（ORF） encoding 629 amino acid proteins， including Nterminal transit peptide， metalbinging domain and DDXXD motif. [Conclusion] The fulllength cDNA of αpinene synthase gene was cloned， which has the typical characteristics of monoterpene synthase gene. The sequence has been submitted to GeneBank， accessin No. KF547035.

Key words Pinus massoniana； Pinene Synthase Gene； RACE

馬尾松（Pinus massoniana）是我國特有的一種綜合利用價值較高的經(jīng)濟樹種，分布廣泛，種植面積居全國針葉林首位，然而馬尾松也是發(fā)生病蟲害較多的樹種，如松材線蟲、馬尾松毛蟲、松梢螟及赤枯病等[1]。近20～30年來，以松材線蟲病最為嚴重，該病致死速度快、傳播蔓延迅速，導致馬尾松大面積死亡，森林生態(tài)遭到嚴重破壞，同時也帶來巨大的經(jīng)濟損失。

萜烯類化合物是針葉樹主要的代謝產(chǎn)物，在受到外來植食性昆蟲及致病菌的危害后，分泌并釋放揮發(fā)性的單萜烯是其最重要的防御措施之一[2-3]。馬尾松合成并揮發(fā)的單萜烯類物質(zhì)主要由蒎烯組成，其中α蒎烯占較大比例，而β蒎烯相對較少[4-5]。當馬尾松受到松材線蟲[6]、松墨天牛[7]、馬尾松毛蟲[8]的危害，以及機械損傷[9]時，α蒎烯含量表現(xiàn)出明顯的上升趨勢。由此可見，α蒎烯是馬尾松在次生代謝水平上的重要的防御物質(zhì)。在分子水平上，α蒎烯受α蒎烯合成酶（αPinene Synthase，apin）基因調(diào)控。如北美云杉（Sitka Spruce）在受到象鼻蟲取食后，α蒎烯合成酶基因在轉錄水平上明顯升高，木質(zhì)部樹脂道中α蒎烯的含量也明顯增加[10]。已有大量的研究表明[11-13]，蒎烯合成酶基因是松科植物重要的與防御相關的單萜烯合成酶基因。馬尾松蒎烯合成酶基因尚未被克隆，馬尾松與病蟲害互作過程中防御基因表達模式研究也為空白。筆者利用同源克隆結合RACE的方法克隆馬尾松α蒎烯合成酶基因cDNA全長，并分析該基因的特性，以期為馬尾松響應病蟲害的分子防御機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 供試材料為3年生馬尾松，購買于浙江省淳安縣國有林場，在現(xiàn)代化溫室中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 馬尾松總RNA提取及cDNA第1鏈合成。切取健康馬尾松的韌皮部組織，放入液氮中研磨。使用RNAplant Plus植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN）提取馬尾松總RNA，按說明書步驟進行。提取的總RNA經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證其完整性，應保證RNA 3端和5端無降解。以馬尾松總RNA為模板，在MMLV酶的催化下，加入Oligo（dT）引物進行逆轉錄，獲得cDNA第1鏈。

1.2.2 引物序列。根據(jù)其他松科植物α蒎烯合成酶基因保守區(qū)域設計一對引物MidF和MidR，利用該引物對馬尾松cDNA模板進行PCR擴增，擴增出α蒎烯合成酶基因的部分片段，經(jīng)測序正確后，再根據(jù)這段已知序列設計3 RACE和5 RACE所需引物，所有引物序列見表1。

1.2.3 3 RACE。以馬尾松總RNA為模板，在MMLV酶的催化下，加入接頭引物3GSP進行逆轉錄，獲得cDNA第1鏈。用引物3F和3R1對逆轉錄產(chǎn)物進行第1輪 PCR擴增，由于基因自身豐度較低，電泳檢測并未出現(xiàn)條帶，因此用引物3F和內(nèi)部引物3R2進行第2輪 PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目的條帶克隆至pMD18T載體并轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞，菌液培養(yǎng)后涂布于含有抗生素的LB固體培養(yǎng)基中，挑取單菌落擴大培養(yǎng)，而后提取質(zhì)粒，將含有插入片段的轉化子送交測序。

3 結論與討論

萜烯類合成酶（terpene synthase，TPS）是萜烯類物質(zhì)合成過程中的關鍵酶，按形成產(chǎn)物的不同，可分為單萜烯合成酶、倍半萜烯合成酶和二萜烯合成酶等，它們都是以異戊烯基二磷酸（IPP）為前體底物合成相應的單萜、倍半萜和二萜[14-16]。目前，在針葉樹中已報道了70多種TPS，主要集中在松科（Pinaceae），其中以大冷杉（Abies grandis）居多，挪威云杉（Picea abies）次之，而松屬（Pinus）較少。

蒎烯合成酶是松科植物重要的與防御相關的單萜烯合成酶[15-17]。試驗通過RACE的方法克隆得到馬尾松α蒎烯合成酶基因，該基因cDNA全長序列共1 890 bp，編碼629個氨基酸。編碼蛋白的預測分子量為71.94 kD。裸子植物萜烯類合成酶的催化反應都需要一價的金屬陽離子（如K+）激活；并且需要2價金屬陽離子協(xié)助，如Mn2+，F(xiàn)e2+，Mg2+等[15，17-18]。此外，幾乎所有的萜烯類合成酶都含有1個天冬氨酸富集基序（DDxxD），這個基序被認為起到結合金屬離子的作用，其定位在活性位點的入口處，在引導底物催化時發(fā)揮重要的作用[19]。馬尾松α蒎烯合成酶基因編碼蛋白在305～573位有1個金屬結合結構域，在380～384位有1個天冬氨酸富集基序（DDMYD），這些都符合萜烯合成酶基因的典型特征。遺傳分析表明，松科植物α蒎烯合成酶基因親緣關系較近，馬尾松（Pinus massoniana）與 火炬松（Pinus teada）、油松（Pinus tabuliformis）等種間相比，基因同源性達到97%。α蒎烯是馬尾松重要的防御物質(zhì)，樹體內(nèi)α蒎烯的含量變化與病蟲害等生物脅迫存在顯著的相關性，因此α蒎烯合成酶基因的克隆，有助于從分子水平上揭示馬尾松的防御機制，為進一步研究馬尾松與有害生物之間的互作打下基礎。

參考文獻

[1] 汪秀楓.馬尾松常見病蟲害防治簡介[J].安徽林業(yè)，2010（3）：67.

[2] ZULAK K G，BOHLMANN J.Terpenoid biosynthesis and specialized vascular cells of conifer defense [J].Integrative Plant Biology，2010，52（1）：86-97.

[3] EFRAIM L，THOMAS J S，MARK G，et al.Simultaneous analysis of monoterpenes and diterpenoids of conifer oleoresin [J].Phytochemical Analysis，2007，4（5）：220-225.

[4] 趙成華，伍德明，閻云花，等.馬尾松針葉中揮發(fā)性成分的鑒定及其對馬尾松毛蟲的觸角電位反應[J].林業(yè)科學，1995，31（2）：125-131.

[5] 寧眺，樊建庭，方宇凌，等.不同危害狀態(tài)下寄主萜烯揮發(fā)物含量的變化及松墨天牛對其組分的觸角電位反應[J].昆蟲學報，2006，49（2）：179-188.

[6] 趙振東，胡樨萼，李冬梅，等.抗松材線蟲病馬尾松種源化學成分與抗性機理研究（第Ⅲ報）—接種松材線蟲引起抗性馬尾松種源中性萜類含量變化關系的研究[J].林產(chǎn)化學與工業(yè)，2001，21（3）：52-58.

[7] NIU H T，ZHAO L L，LU M，et al.The Ratio and Concentration of Two Monoterpenes Mediate Fecundity of the Pinewood Nematode and Growth of Its Associated Fungi [J].PLoS ONE，2012，7（2）：1-7.

[8] 任琴，李鎮(zhèn)宇，胡永建，等.受害馬尾松、濕地松揮發(fā)性化學物質(zhì)的釋放[J].生態(tài)學報，2005，25（11）：2928-2932.

[9] KEELING C I，BOHLMANN J.Genes，enzymes and chemicals of terpenoid diversity in the constitutive and induced defence of conifers against insects and pathogens [J].New Phytologist，2006，170（4）：657-675.

[10] MCKAY S A B，HUNTER W L，GODARD K A，et al.Insect Attack and Wounding Induce Traumatic Resin Duct Development and Gene Expression of（）Pinene Synthase in Sitka Spruce [J].Plant Physiology，2003，133（1）：368-378.

[11] GIJZEN M，LEWINSOHN E，CROTEAU R.Characterization of the constitutive and woundinducible monoterpene cyclases of grand fir（Abies grandis）[J].Archives of Biochemistry and Biophysics，1991，289（1）：267-273.

[12] LEWINSOHN E，GIJZEN M，CROTEAU R.Woundinducible pinene cyclase from grand fir：purification，characterization and renaturation after SDSPAGE [J].Archives of Biochemistry and Biophysics，1992，293（1）：167-173.

[13] GERON C，RASMUSSEN R，ARNTS R R，et al.A review and synthesis of monoterpene speciation from forests in the United States [J].Atmospheric Environment，2000，34（11）：1761-1781.

[14] TRAPP S C，CROTEAU R B.Genomic organization of plant terpene synthases and molecular evolutionary implications [J].Genetics Society of America，2001，158（2）：811-832.

[15] LIANG P H，KO T P，WANG A H J.Structure，mechanism and function of prenyl transferases [J].European Journal of Biochemistry，2002，269（14）：3339-3354.

[16] THOLL D.Terpene synthases and the regulation，diversity and biological roles of terpene metabolism [J].Current Opinion in Plant Biology，2006，9（3）：297-304.

[17] DEGENHARDT J，KOLLNER T G，GERSHENZON J.Monoterpene and sesquiterpene synthases and the origin of terpene skeletal diversity in plants [J].Phytochemistry，2009，70（15/16）：1621-1637.

[18] BOHLMANN J，MEYERGAUEN G，CROTEAU R.Plant terpenoid synthases：Molecular biology and phylogenetic analysis [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1998，95（8）：4126-4133.

[19] SACCHETTINI J C，POULER C D.BiochemistryCreating isoprenoid diversity [J].Science，1997，277（5333）：1788-1789.