昌偉 李子龍 胡燦麗 范敬偉 王建立 楊瑞

(1.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)お

摘要

［目的］探索過量表達(dá)miR319和過量表達(dá)LA對(duì)番茄果實(shí)品質(zhì)的影響。［方法］以番茄野生型M82、過量表達(dá)miR319和過量表達(dá)LA番茄為材料，分析過量表達(dá)miR319和過量表達(dá)LA對(duì)番茄果實(shí)品質(zhì)的影響。［結(jié)果］過量表達(dá)miR319植株的可滴定酸、可溶性糖、V瑿和番茄紅素的含量下降，而過量表達(dá)LA植株的可滴定酸、可溶性糖、番茄紅素的含量上升，V瑿含量下降。2個(gè)轉(zhuǎn)基因植株可溶性蛋白的含量與M82比較都有所上升。［結(jié)論］過量表達(dá)miR319和過量表達(dá)LA對(duì)番茄果實(shí)品質(zhì)的影響是相反的，過量表達(dá)LA可以提高番茄果實(shí)品質(zhì)。

關(guān)鍵詞 番茄（玈olanumlycopersicum）；miR319；番茄品質(zhì)

中圖分類號(hào) SB188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2014）19-06150-02

お

Effect of Over睧xpression miR319 on Fruit Quality of Tomato

CHANG Wei, YANG Rui et al

(College of Plant Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206)

Abstract ［Objective］ The present study aimed to explore the effects of over瞖xpression miR319 and over瞖xpression LA on fruit quality of tomato. ［Method］ Effects of over瞖xpression miR319 and over瞖xpression LA on fruit quality of tomato were analyzed by using tomato wild type M82, over瞖xpression miR319 and over瞖xpression LA as material. ［Result］ The results showed that: The over瞖xpression jaw睤 titratable acid, soluble sugar content V瑿 and Lycopene content were decreased, but over瞖xpression LA, plant titratable, soluble sugar content and Lycopene content were increased, and V瑿 content was decreased. And two transgenic plants soluble protein content were better than M82. ［Conclusion］ The effects of over瞖xpression of miR319 and over瞖xpression LA on fruit quality of tomato are opposite and overexpression LA can improve fruit quality .

Key words Tomato; MiR319; Tomato nutritional quality

お

基金項(xiàng)目 長(zhǎng)城學(xué)者（CIT·&·TCD20130323）。

作者簡(jiǎn)介

昌偉（1989-），男，安徽滁州人，碩士研究生，研究方向：蔬菜生理與優(yōu)質(zhì)安全栽培。*通訊作者，實(shí)驗(yàn)師，從事蔬菜生理與優(yōu)質(zhì)安全研究。

收稿日期 20140531

番茄（玈olanumlycopersicum）是蔬菜中營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的品種之一，也是近年來我國(guó)設(shè)施栽培面積較大的作物。番茄果實(shí)的發(fā)育是通過一系列生物和非生物因素相互調(diào)控的。茉莉酸作為植物調(diào)節(jié)劑，可以在番茄的整個(gè)生長(zhǎng)過程起到非常重要的作用。魏佳等［1］發(fā)現(xiàn)利用茉莉酸突變體玸pr2發(fā)現(xiàn)茉莉酸能夠促進(jìn)果實(shí)發(fā)育時(shí)期還原糖的積累。張佳楠等［2］利用Micro-Tom為試驗(yàn)材料，外源噴施茉莉酸甲酯，發(fā)現(xiàn)番茄果實(shí)中果糖和葡萄糖含量在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期都呈遞增趨勢(shì)。Schommer等［3］研究發(fā)現(xiàn)，miR319的靶基因TCP轉(zhuǎn)錄因子家族成員調(diào)控茉莉酸生物合成進(jìn)程中關(guān)鍵酶基因LOX2從而控制著茉莉酸的生物合成。筆者以M82為背景的過量表達(dá)miR319和過量表達(dá)LA為材料，比較3個(gè)品種番茄果實(shí)的品質(zhì)差異，探索miR319對(duì)番茄果實(shí)的影響，以期為番茄的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2013年10月~3月在北京金六環(huán)農(nóng)業(yè)園進(jìn)行。試驗(yàn)材料為番茄野生種M82，以M82為背景的過量表達(dá)miR319和過量表達(dá)LA的轉(zhuǎn)基因番茄。取新鮮果實(shí)，研磨成原漿，按照不同試驗(yàn)要求精確稱量勻漿，然后進(jìn)行各項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2 可溶性蛋白的測(cè)定

用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定［4］。準(zhǔn)確稱取4.000 g番茄果實(shí)勻漿，加入10 ml蒸餾水混勻，于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液即為可溶性蛋白溶液。吸取1.0 ml上清液，加入5.0 ml考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，充分混合，放置2 min后在波長(zhǎng)595 nm出比色。重復(fù)3次。

1.3 可溶性糖的測(cè)定

采用硫酸蒽酮比色法［4］，準(zhǔn)確稱取0.500 g番茄果實(shí)勻漿，加入到15 ml蒸餾水中，沸水煮沸20 min，冷卻后定容至25 ml。離心10 min（5 000 r/min），上清液為待測(cè)液，在620 nm下測(cè)得吸光度。重復(fù)3次。

1.4 有機(jī)酸總量的測(cè)定

采用標(biāo)準(zhǔn)堿滴定定量法。取10.0 g勻漿，約用50 ml已煮沸、冷卻的蒸餾水定容 250 ml。充分振蕩后過濾。吸取20 ml濾液，加入酚酞，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定。重復(fù)3次。

1.5 維生素C的測(cè)定

采用2,6-二氯酚靛酚法測(cè)定［4］。準(zhǔn)確稱取5.000 g番茄果實(shí)勻漿，加入10 ml濃度2%草酸，轉(zhuǎn)移到50 ml容量瓶中定容。用高嶺土和溶液混合，過濾。取10 ml濾液，用已標(biāo)定的2,6-二氯酚靛酚溶液滴定。重復(fù)3次。

1.6 番茄紅素的測(cè)定

用GB/T 14215-2008番茄醬罐頭標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)量番茄紅素的方法測(cè)量［5］。準(zhǔn)確稱取0.200 g番茄果實(shí)勻漿，置于10 ml燒杯中，加入少量無水甲醇，過濾，反復(fù)至無色，保留殘?jiān)７执斡蒙倭考妆浇岱鸭t素，過濾，至濾液無色，濾液定容至50 ml。在485 nm下測(cè)定提取液的吸光度。重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel2007、spss19.0和origin8分別進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、差異顯著性分析和作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因植株對(duì)番茄果實(shí)可溶性糖的影響

圖1表明，M82、過量表達(dá)miR319植株、過量表達(dá)LA植株的含糖量分別是5.69%、4.52%和7.49%。過量表達(dá)miR319之后番茄果實(shí)的含糖量下降，而過量表達(dá)miR319靶基因LA之后，番茄果實(shí)的含糖量上升。這可能是在番茄果實(shí)成熟時(shí)，糖含量受到miR319的調(diào)控，從而使番茄果實(shí)的含糖量下降。結(jié)果表明，在番茄果實(shí)成熟時(shí)，過量表達(dá)miR319植株的番茄果實(shí)含糖量下降，而過量表達(dá)LA植株的番茄果實(shí)含糖量上升。miR319可能單獨(dú)或者聯(lián)合其他機(jī)制調(diào)控果實(shí)糖積累時(shí)的過程，是果實(shí)內(nèi)的糖含量發(fā)生變化。

注：不同大寫字母表示差異極顯著，不同小寫字母表示差異顯著，相同字母表示差異不顯著，下同。

圖1 不同番茄果實(shí)含糖量

2.2 轉(zhuǎn)基因植株對(duì)番茄果實(shí)可滴定酸的影響

圖2表明，M82果實(shí)的可滴定酸含量為0.61%，過量表達(dá)miR319植株的果實(shí)可滴定酸含量為0.48%，下降0.13%，下降達(dá)到極顯著（㏄<0.01）。過量表達(dá)LA果實(shí)的可滴定酸含量增加0.1%，增加達(dá)到極顯著（玃<0.01）。這可能在番茄果實(shí)成熟的過程中，可滴定酸含量受到miR319的負(fù)調(diào)控，從而使番茄果實(shí)內(nèi)的可滴定酸含量下降；而過量表達(dá)miR319靶基因LA時(shí)，抑制了miR319的表達(dá)，使番茄果實(shí)內(nèi)的可滴定酸含量┥仙。

圖2 不同番茄果實(shí)可滴定酸含量

2.3 轉(zhuǎn)基因植株對(duì)番茄果實(shí)可溶性蛋白的影響

圖3表明，M82、過量表達(dá)miR319植株、過量表達(dá)LA植株的蛋白質(zhì)含量為分別是122.1、138.5和134.4 μg/g。過量表達(dá)miR319和過量表達(dá)LA植株番茄果實(shí)的可溶性蛋白相對(duì)于M82來說分別上升16.4和13.3 μg/g，上升都達(dá)到了顯著性（玃<0.05）。有可能是在番茄果實(shí)成熟的過程中，過量表達(dá)miR319和過量表達(dá)LA植株體內(nèi)的誘導(dǎo)番茄果實(shí)中其他蛋白質(zhì)的表達(dá)，使果實(shí)內(nèi)的可溶性蛋白含量上升。

圖3 不同番茄可溶性蛋白含量

2.4 轉(zhuǎn)基因植株對(duì)番茄果實(shí)維生素C的影響

圖4表明，M82、過量表達(dá)miR319和過量表達(dá)LA的維生素C的含量分別是1 762.7、1 440.7和1 593.2 mg/kg。結(jié)果表明，在番茄果實(shí)成熟時(shí)，過量表達(dá)miR319植株的番茄果實(shí)和過量表達(dá)LA植株的番茄果實(shí)的維生素C含量都有所下降。與野生番茄M82相比較都有極顯著差異（玃<0.01）。在番茄果實(shí)成熟的時(shí)候，過表達(dá)miR319和過表達(dá)LA的維生素C含量下降。

圖4 不同番茄維生素C含量

2.5 轉(zhuǎn)基因植株對(duì)番茄果實(shí)番茄紅素的影響

圖5表明，M82、過量表達(dá)miR319和過量表達(dá)LA的番茄紅素含量分別為89.0、84.0和98.0 mg/kg FW。與M82相比，過量表達(dá)miR319植株的番茄果實(shí)番茄紅素下降5.0 mg/kg FW，而過量表達(dá)LA植株的番茄果實(shí)番茄紅素上升9.0 mg/kg FW，效果顯著（玃<0.05）。汪俏梅等［6］研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源茉莉酸能通過郵箱番茄紅素合成相關(guān)基因而正調(diào)控番茄紅素的合成，MeJA處理可以提高番茄紅素的合成。試驗(yàn)結(jié)果表明，在過量表達(dá)miR319植株中，miR319負(fù)調(diào)控茉莉酸合成通路中Lox2基因，使番茄內(nèi)的茉莉酸含量下降，從而使果實(shí)內(nèi)的番茄紅素下降。而在過量表達(dá)LA植株中，正向調(diào)控茉莉酸表達(dá)，使番茄中茉莉酸含量上升，使番茄果實(shí)內(nèi)的番茄紅素含量上升。

圖5 不同番茄紅素含量

3結(jié)論與討論

番茄作為模式植物，在番茄的轉(zhuǎn)基因上科學(xué)家們做了大量的試驗(yàn)，主要包括一些抗病蟲害、提高產(chǎn)量、延遲成熟等品種。1994年，Calgene公司第1次將多聚半乳糖醛酸酶的反

義cDNA轉(zhuǎn)入番茄的基因組中，首先研制出了延遲成熟的轉(zhuǎn)基因番茄Flavr-SavrTMP中，并被批準(zhǔn)用于商業(yè)化種植，這給研制轉(zhuǎn)基因番茄提供了可行性。但是現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因食品在國(guó)內(nèi)沒有得到大范圍的推廣。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在過量表達(dá)miR319植株番茄果實(shí)中可溶性糖和可溶性蛋白都有所下降，說明在番茄果實(shí)成熟期，過量表達(dá)miR319植株體內(nèi)中miR319表達(dá)量的提高，導(dǎo)致植株體內(nèi)茉莉酸含量下降，使可溶性糖和可溶性蛋白的含量下降，而在過量表達(dá)miR319靶基因LA植株中，使茉莉酸含量上升，可溶性糖和可溶性蛋白的含量上升，這與前人的研究一致［1］。激素對(duì)植物體的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)機(jī)制是非常復(fù)雜的，通常果實(shí)發(fā)育并不是由單一激素來調(diào)控的，大多是多個(gè)激素共同調(diào)控的結(jié)果。所以下一步的工作可以通過對(duì)多個(gè)激素共同的作用來研究對(duì)番茄果實(shí)的影響。

利用轉(zhuǎn)基因植株來研究果實(shí)的生長(zhǎng)機(jī)制和提高番茄產(chǎn)量是農(nóng)業(yè)科學(xué)非常重要的手段。從試驗(yàn)結(jié)果到生產(chǎn)實(shí)踐是需要非常長(zhǎng)的時(shí)間和機(jī)制。試驗(yàn)僅僅是從果實(shí)品質(zhì)來評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因番茄，如果后期要大面積推廣，應(yīng)該嚴(yán)格按照國(guó)家關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并且在種植過程中為防止轉(zhuǎn)基因番茄破壞生態(tài)平衡，應(yīng)該在相對(duì)封閉的環(huán)境中種植和管理，要嚴(yán)格與傳統(tǒng)的農(nóng)作物分開，規(guī)范轉(zhuǎn)基因番茄的生產(chǎn)和加工過程。

參考文獻(xiàn)

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