章志超 桂萌 李平蘭
摘 要:特定腐敗菌(specific spoilage organisms,SSOs)是影響魚肉腐敗的重要因素之一。不同條件下魚源SSOs不同,本文重點就SSOs的確定,即魚源優(yōu)勢腐敗菌篩選及其腐敗能力分析的研究現(xiàn)狀進行概述。在此基礎上,對魚源SSOs生長預測,靶向控制以延長魚類鮮品貨架期等應用研究進行了總結,旨在說明魚源SSOs的研究價值,并對SSOs未來研究方向進行了展望。
關鍵詞:魚;特定腐敗菌;分類;確定;預測;控制
Advances in Specific Spoilage Organisms in Fish and Their Applications
ZHANG Zhi-chao, GUI Meng, LI Ping-lan*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)
Abstract: Specific spoilage organisms (SSOs) are one of important factors affecting fish spoilage, which vary under different conditions. This article focuses on the current status of research on the screening and spoilage abilities of predominant SSOs in fish. In addition, we summarize recent research on growth prediction of SSOs in fish and their targeted control for extending the shelf life of fish products. From this review, we know that SSOs in fish are worth studying. Furthermore, we discuss future research trends in this area.
Key words: fish; specific spoilage organisms (SSOs); classification; confirmation; prediction; control
中圖分類號:TS254.4 文獻標志碼:A 文章編號:1001-8123(2014)03-0025-06
目前我國消費者傾向于購買活魚,但活魚銷售不僅增加了運輸成本,且會帶來大量的城市生鮮垃圾,不利于漁業(yè)整體發(fā)展[1]。因此采用便于銷售的小包裝形式處理鮮魚,使產品直接進入超市貨架具有重要意義。但魚肉營養(yǎng)豐富,水含量高等特性使其容易腐敗,同時Gram等[2-3]研究發(fā)現(xiàn):在貯藏過程中逐漸占據(jù)優(yōu)勢地位并產生腐敗代謝產物,最終導致肉品腐敗的腐敗能力強的特定腐敗菌(specific spoilage organisms,SSOs)是促使魚肉腐敗的最重要原因之一,因此對SSOs確定,并進行靶向抑制將是研究魚肉保鮮的重點。由于不同條件下魚體微生物分布不同,本文對魚類產品在不同條件下的SSOs分類,重點就魚源優(yōu)勢腐敗菌篩選及其腐敗能力分析,以確定SSOs的研究現(xiàn)狀進行了分析,最后就SSOs生長預測,靶向控制以延長魚類產品貨架期等應用研究進行了總結,為了解SSOs的腐敗特性及魚類產品品質控制提供參考。
1 特定腐敗菌
由于各種微生物對所處環(huán)境適應能力不同,因此魚類的棲息環(huán)境和加工流通條件等差異會影響魚體的微生態(tài)系統(tǒng),使魚類貯藏過程中的SSOs種類或數(shù)量發(fā)生變化[4]。
1.1 不同棲息環(huán)境的影響
魚體所含的細菌主要來源于水中,大多數(shù)為需氧型細菌。它們的初始菌相受品種、外界環(huán)境影響,其中魚類棲息水域的溫度和鹽度是影響菌相組成的主要因素[5-6]。Svanevik等[7]對魚體分布的微生物進行了總結:來源寒帶、溫帶干凈水域的魚體主要攜帶的是革蘭氏陰性嗜冷菌,包括一些好氧菌及兼性厭氧菌;而熱帶水域菌群與溫帶水域相似,但魚體嗜溫菌比例較高。同時已有研究表明:有氧冷藏溫、熱帶水域淡水魚的SSOs為假單胞菌屬(Pseudomonas sp.),有氧冰藏海水魚的SSOs為腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefacens)[8];Gillespie等[9]在研究澳大利亞和非洲等熱帶水域捕獲的魚類時發(fā)現(xiàn)微球菌屬(Micrococcus sp.)也是優(yōu)勢腐敗菌之一。同時即使同一種魚,魚體微生物分布會因捕獲地域、時間的不同而有所差異。le Nguyen等[10]對越南不同地區(qū)的5個農場,不同季節(jié)(雨季、旱季)的鯰魚鰓、腸道和表皮菌群多樣性分析表明:不同地區(qū)、時間及取樣部位的不同,鯰魚的優(yōu)勢菌群也有特異性差異,該研究認為這與飼喂方法、水源、pH值等有關,這為鯰魚的可溯源性提供了參考。
1.2 不同加工工藝、流通條件的影響
魚肉極易腐敗,貨架期短,因此往往通過物理、化學手段或添加劑處理等方法改進貯藏工藝,但這會導致魚肉微生物分布發(fā)生極大變化。藍蔚青等[11]研究發(fā)現(xiàn)有氧冷藏帶魚的SSOs是希瓦氏菌(Shewanella sp.)與熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens),但用殼聚糖、茶多酚和溶菌酶等配制的復合保鮮劑處理后,SSOs受到明顯抑制。此外,為控制魚肉腐敗,不同包裝形式下的SSOs也是研究重點之一。大量研究表明,在有氧包裝中,假單胞菌、希瓦氏菌是魚肉貯藏中的SSOs;而真空包裝和氣調包裝抑制了好氧菌的生長,兼性厭氧菌如乳酸菌、熱殺索絲菌(Brochothrix thermosphacta)等則占聚生長優(yōu)勢,發(fā)光磷桿菌(Photobacterium phosphoreum)則常是氣調包裝中的SSOs[12-17]。
不同流通條件同樣會對魚體微生物分布產生重要影響。Svanevik等[7]對直接取自圍網漁船和從圍網漁船轉移至冷藏運輸箱后的大西洋馬鮫魚的SSOs分析,研究表明:轉移放置后菌相發(fā)生了改變,優(yōu)勢腐敗菌增加。同時貯藏溫度在魚類產品貨架期研究中考慮較多,被認為是影響魚類腐敗的最重要因素[18],主要影響微生物的生長速率,從而導致SSOs的數(shù)量發(fā)生變化。
雖然不同環(huán)境影響使魚源SSOs的種類或數(shù)量有所差異,但在同等加工貯藏條件下,只有一種或幾種微生物總是作為SSOs出現(xiàn)(表1)[2]。
表 1 魚肉在不同加工貯藏條件下常見的SSOs[2,12-15,19]
Table 1 The common SSOs from fish in different processing or
storage conditons[2,12-15,19]
加工方式 貯藏方式 SSOs
鮮魚 空氣,冷藏 假單胞菌(Pseudomonas sp.)、腐敗希瓦氏菌
(Shewanella putrefacens)、
氣調或真空,冷藏 磷發(fā)光桿菌(Photobacterium phosphoreum)、
乳酸菌、熱殺索絲菌(Brochothrix thermosphacta)
空氣,大于
10~15℃ 假單胞菌、腸科菌(Enterobacteriaceae)、
弧菌(Vibrio sp.)
低鹽、略酸化等 真空,冷藏 乳酸菌、發(fā)光磷桿菌、嗜冷腸科菌
半保藏(醋漬、腌魚等) 真空,冷藏 乳酸菌、酵母
溫和熱處理(巴氏殺菌等) 空氣,冷藏 芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)
干魚 空氣,常溫 絲狀真菌
熟魚 空氣,常溫 假單胞菌、腸科菌(Enterobacteriaceae)
2 特定腐敗菌的確定
為了控制魚肉腐敗,延長魚類產品的貨架期,SSOs的確定顯得十分重要。根據(jù)SSOs的定義,SSOs不僅是腐敗終點的生長優(yōu)勢菌株,而且應具備能夠產生腐敗代謝產物,腐敗能力強等特點。因此,對于SSOs的確定必須同時從生長優(yōu)勢菌的篩選及其腐敗能力2個方面分析。
2.1 腐敗終點優(yōu)勢菌的篩選
監(jiān)測優(yōu)勢菌的傳統(tǒng)方法主要通過選擇性培養(yǎng)結合生理生化鑒定進行,但傳統(tǒng)方法盲目性大、費時費力,且靈敏度低,鑒定結果非常不穩(wěn)定[18]。近年來,不依賴于傳統(tǒng)培養(yǎng)的檢測手段越來越多地應用于食品腐敗菌的分析中。這些新型技術具有檢測快速、靈敏度高、分析全面等優(yōu)點,從而使優(yōu)勢菌的篩選更具有針對性。根據(jù)相關文獻報道,主要可分為PCR依賴型方法和PCR非依賴型方法。這主要包括:特異性PCR、實時定量PCR、細菌基因組重復序列PCR(repetitive extragenic palindromic-PCR,rep-PCR)、變性/溫度梯度凝膠電泳法(denaturing/temperature gradient gel electrophoresis,DGGE/TGGE)、脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)、末端限制性片段長度多態(tài)性(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)、單鏈構型多態(tài)性(single-strand conformation polymorphism,SSCP)、核糖體DNA擴增片段限制性分析(amplified ribosomal DNA restriction analysis,ARDRA)、核糖體基因間區(qū)分析(ribosomal intergenic spacer analysis,RISA)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,F(xiàn)ISH)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)等[18-20]。這些方法在畜禽產品、水產品的生長優(yōu)勢菌的研究中都各有特點及特定適用范圍。近年來關于魚肉在貨架期終點的優(yōu)勢腐敗菌分析所采用的方法總結如表2。
表 2 不同方法篩選魚類腐敗優(yōu)勢菌應用舉例
Table 2 Different techniques applied for the screening of
predominant spoilage bacteria in fish
研究方法 研究對象 腐敗優(yōu)勢菌 參考文獻
傳統(tǒng)方法 魚糜:不同
包裝,3℃ 發(fā)光磷桿菌(Photobacterium phosphoreum)、
乳酸菌、微球菌屬(Micrococcus sp.) [21]
鱈魚:有氧包
裝,不同溫度 發(fā)光磷桿菌(Photobacterium phosphoreum)
(冷藏),希瓦氏菌屬(Shewanella sp.)(超冷) [22]
rep-PCR 11種魚:有氧
包裝,冰藏 希瓦氏菌屬、發(fā)光磷桿菌、熱殺
索絲菌(Brochothrix thermosphacta) [12]
羅非魚:有氧
包裝,4℃ 無色桿菌屬(Achromobacter sp.)、
希瓦氏菌屬、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.) [17]
PCR-DGGE 帶魚: 有氧
包裝,4℃ 腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefacens)、
熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens) [19]
大比目魚:不同
包裝,4℃ 假單胞菌屬(有氧),希瓦氏菌屬、
發(fā)光磷桿菌(氣調) [23]
PCR-TTGE 大馬哈魚:氣調
包裝,不同溫度 蜂房哈夫尼亞菌(Hafinia alvei)、發(fā)光磷桿菌 [14,24]
RFLP 鱈魚:不同水
域,不同季節(jié) 發(fā)光磷桿菌、嗜冷桿菌(Psychrobacter)、
擬桿菌屬(Bacteroides) [25]
2.2 腐敗能力研究
魚體腐敗過程中某些微生物代謝生成硫化物、吲哚、醛類、酯類及低級脂肪酸等各種具有腐臭特征的產物,使魚肉原有的形態(tài)和色澤發(fā)生劣變,并產生腐敗特征的不良氣味和異味[8]。因此對于SSOs的確定,僅通過對腐敗優(yōu)勢菌的鑒定遠不夠,需結合感官、理化等指標對腐敗優(yōu)勢菌的腐敗能力進行分析[2]。
為確定大馬哈魚氣調包裝下的SSOs,MAC?等[24]提出了兩步分析法,即從氣調包裝腐敗期的大馬哈魚中篩選出的8株潛在腐敗菌進行挑戰(zhàn)性實驗,對微生物指標及感官指標進行比較,篩選出3株腐敗能力較強的菌株;進一步將這3株菌單一或混合反接于無菌魚塊中,對感官、微生物及理化指標進行分析后確定一株腐敗能力最強的發(fā)光磷桿菌為SSOs。不同學者對菌株腐敗潛力分析時,有人選擇滅菌魚汁為菌株培養(yǎng)基質[26-27]、有人則選擇無菌魚塊[24-28]。滅菌魚汁用于腐敗菌腐敗能力的測定具有快速、簡便的特點,可在短期內獲得大量數(shù)據(jù),但難以模擬魚肉復雜的組織環(huán)境;無菌魚塊則更接近腐敗菌的生長環(huán)境,但操作要求較高[29]。
同時在分析魚肉鮮度變化時,常采用感官評價、微生物(菌數(shù)或微生態(tài)等)及常規(guī)的理化分析(如pH值、揮發(fā)性鹽基氮、三甲胺、脂肪氧化及ATP降解等)等方法。國內相關研究大多只是對腐敗菌的腐敗能力的初步分析,有研究對魚源腐敗菌的腐敗能力進行了定性定量分析,在魚肉感官拒絕點時,將單位腐敗菌產生的腐敗代謝產物(揮發(fā)性鹽基氮、三甲胺等)作為定量指標,對淡水魚(鯉魚、羅非魚)和海水魚(大菱鲆、大黃魚)的SSOs(假單胞菌、腐敗希瓦氏菌)的腐敗能力進行分析[28-31]。但更多的研究主要側重于利用感官、理化及總菌數(shù)指標對魚類在貯藏過程中的鮮度進行簡單評價[32-33]。為了進一步了解魚肉腐敗過程中代謝產生的含氮、胺、氨、醇類和含硫等揮發(fā)性物質,氣相色譜-質譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)、氣相色譜-嗅覺分析(gas chromatography-olfactometry,GC-O)等技術逐步被用于魚肉腐敗期揮發(fā)性化合物的分析[24, 34-36]。根據(jù)SSOs腐敗特性,部分常見SSOs的腐敗特征物質歸納如下:乙酸可作為評價發(fā)光磷桿菌作用的大馬哈魚腐敗的指標[24];2,3-庚烷二酮、3-甲基-1-正丁醛、2,3-丁二酮等是熱殺索絲菌腐敗特征物質;三甲胺、乙酸乙酯和丁醇是液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)的腐敗特征物質;3-甲基-1-正丁醛、2-甲基-1-正丁醛、2,3-丁二酮、乙酸乙酯等是肉梭狀桿菌(Carnobacterium maltaromaticum)的腐敗特征物質[37];腐敗希瓦氏菌及熒光假單胞菌分別作用的無菌美洲平鲉的腐敗特征揮發(fā)性物質以含硫化合物為主[38]。此外,利用高效液相色譜對糖酵解等代謝產生的有機酸變化的檢測也被證明是評價腐敗菌腐敗能力的好方法[39]。
因此,在SSOs的確定中,結合魚源優(yōu)勢腐敗菌的腐敗能力分析,對于了解不同的SSOs或不同魚類的腐敗特點具有重要意義。
3 特定腐敗菌用于魚肉新鮮度檢測研究
3.1 特定腐敗菌生長預測模型
雖然細菌菌落總數(shù)常常是許多國家制定水產品新鮮度標準的重要依據(jù)[40],但水產品在不同條件下腐敗特性會有所差異,因而根據(jù)細菌菌落總數(shù)評價鮮度往往不夠準確。Olafsdottir等[22]研究表明:魚肉貯藏中,希瓦氏菌、熱殺索絲菌等SSOs的數(shù)目與魚肉鮮度的相關性總體高于細菌菌落總數(shù),SSOs是評價魚肉鮮度更為適宜的指標。因此,建立與食品品質高度關聯(lián)的SSOs的生長預測模型對簡化分析實驗,預測剩余貨架期具有重要應用價值。
預測微生物模型已廣泛應用于食品行業(yè)當中。根據(jù)模型中變量的不同,微生物預測模型可分為3類:1)一級模型,描述特定條件下微生物數(shù)量隨時間變化的關系;2)二級模型,反映環(huán)境因子(溫度、pH值、αw值等)對微生物生長的影響;3)三級模型,即建立在一、二級模型的基礎上的計算機共享軟件,也稱為專家系統(tǒng)[41]。
目前,修正的Gompertz模型、Baranyi模型及Logistic模型是應用較為廣泛的一級生長預測模型,其中Baranyi模型主要是在Logistic模型的基礎上引入了遲滯期參數(shù)獲得[42]。Xiong等[43]認為:當一級模型單獨使用時,Gompertz模型優(yōu)于Baranyi模型;但與二級模型聯(lián)用時,Baranyi模型更好。此外,新型的一級模型——Huang模型近年來也引起人們的關注,當不考慮史前效應等對微生物生長的影響時,Huang模型優(yōu)于Baranyi模型[44-45],但在魚源SSOs的應用中尚未見報道。牛會敏等[46]在建立冷卻豬肉中假單胞菌的最適一級模型時認為:0 ℃為Baranyi模型;5 ℃為修正的Gompertz模型;10 ℃為Huang模型,可見貯藏溫度影響一級模型的選擇。同樣溫度也是肉品SSOs的二級模型研究中考慮最多的因素。在二級模型中,平方根模型及Arrhenius模型使用最為普遍。郭全友等[47]比較了由平方根方程與Arrhenius方程建立的不同溫度對假單胞菌生長動力學影響的數(shù)學模型,結果表明,平方根模型對微生物的最大比生長速率、生長延滯期的預測較Arrhenius模型偏差小。Alfaro等[48]對分離至馬鮫魚的SSOs的預測模型分析時,則考慮了溫度及CO2濃度對菌生長的影響,并在恒定及波動溫度下得到很好地驗證。對于此類多因素情況下的模型分析較為復雜,國內的相關文獻報道則較少。此外,三級模型的研究仍處于起步階段,目前Combase是關于食品微生物生長模型的全球最大數(shù)據(jù)庫,但由于微生物生長具體環(huán)境模擬的局限性等,三級模型還有待進一步開發(fā)與完善。
實際研究中,SSOs生長預測模型生物最重要的價值之一在于可預測產品剩余貨架期,進行定量風險評估。通過確定SSOs的最小腐敗量,結合一、二級模型可對一定溫度范圍的產品剩余貨架期進行預測。許鐘等[49]研究了0~15℃范圍的2種波動溫度條件下,對有氧貯藏養(yǎng)殖羅非魚的SSO(假單胞菌)建立了修正的Gompertz模型與平方根模型,剩余貨架期預測值與實測值的相對誤差分別為5.9%與-9.1%,預測效果較好;陳睿等[50]則利用Baranyi模型和平方根模型建立的2~15℃下真空包裝早餐腸的貨架期預測模型也能夠快速準確的預測產品的貨架期。
盡管預測微生物學研究得到極大發(fā)展,但在實際應用中仍存在一些局限或爭議:1)微生物培養(yǎng)基質的選擇,通常經液體培養(yǎng)基或直接選擇性培養(yǎng)獲得試驗數(shù)據(jù),雖然操作簡便,但沒有考慮到食品基質間的組織復雜性和差異性,或忽視了樣品初始菌數(shù)的差異等因素[12],因此采用SSOs反接于實際研究食品中建模的更有針對性,模擬效果更好[51];2)微生物間的相互作用是影響微生物生長的重要因素,因此利用菌落總數(shù)建模常見于報道[52]。但在魚類等貯藏中,只有少數(shù)菌參與腐敗過程,且研究表明,只有當微生物濃度大于108 CFU/g才有明顯的菌間相互作用[8],建立SSOs的生長預測模型同樣具有現(xiàn)實意義;3)在剩余貨架期的預測中,對產品的感官拒絕點的判斷較為主觀,這也使得SSOs的最小腐敗量界定存在一定的人為偏差。同時,由于魚類等在冷鏈流通中常常面臨溫度的波動,為提高微生物預測模型的實際應用價值,波動溫度下的微生物預測模型也應是研究的重點之一。
3.2 特定腐敗菌靶向控制,延長貨架期
SSOs是引起魚類腐敗的最主要的因素之一,因此抑制SSOs的生長,延長魚類產品貨架期的研究具有重要的現(xiàn)實意義。目前,對于SSOs的控制,主要通過低溫、不同包裝及不同直接保鮮處理等方法實現(xiàn)。
3.2.1 低溫貯藏
貯藏溫度可以影響微生物的生長速率等而被認為是影響肉品腐敗的最重要因素[18],因此鮮魚等不論采取何種貯藏方式都以低溫為基礎,主要包括冷凍貯藏、微凍貯藏、冰溫貯藏和冰鮮貯藏等。雖然凍藏能夠有效地抑制微生物生長,在水產品中應用較多,但凍藏會造成水產品肌肉冷凍變性,持水力下降,風味物質流失嚴重等問題。因此,溫和加工方式不僅能維持產品鮮度,還能有效抑制微生物活動及各種酶的活性,因而成為SSOs靶向控制的研究重點。王慶麗等[53]研究了鱸魚有氧包裝下在微凍(-2 ℃)和冷藏(4 ℃)下的SSOs的變化,結果表明,SSOs都為假單胞菌、腐敗希瓦氏菌,但微凍貯藏對SSOs的生長抑制效果更好,能夠延緩鱸魚品質劣變。Liu等[54]在對冰溫(-3 ℃)和冷藏(4 ℃)草魚的貨架期研究中也得出類似結果。
3.2.2 不同包裝形式
魚類產品主要通過有氧托盤包裝、真空包裝和氣調包裝等形式包裝。不同包裝下貯藏的魚源SSOs的種類會有差異,因而可以通過不同包裝形式的選用來對SSOs進行靶向抑制。Pantazi等[55]對地中海旗魚在不同包裝下的SSOs及貯藏貨架期差異的研究表明:有氧托盤包裝的SSOs是假單胞菌、腐敗希瓦氏菌,真空包裝的SSOs為乳酸菌,氣調包裝則為發(fā)光磷桿菌,同時貨架期比較發(fā)現(xiàn):由于不同環(huán)境下,SSOs的生長及代謝差異使得氣調包裝時貨架期最長,有氧托盤包裝時則腐敗最快。國內學者對不同包裝的魚糜的研究也得出了類似結果[21]。但有報道認為:與畜禽肉相比,氣調包裝氣調包裝對對鮮魚的保鮮效果并不好,如CO2用包裝雖然抑制了有氧包裝時的SSOs(腐敗希瓦氏菌和假單胞菌)的生長,但發(fā)光磷桿菌成為新的SSOs,保鮮效果并沒有得到很好的改善[56]。
3.2.3 不同保鮮處理
采用物理、化學及生物保鮮劑等手段直接對魚類產品的SSOs控制,延長貨架期的研究較多,尤其生物保鮮劑的開發(fā)是目前的研究熱點之一。施建兵等[57]用化學方法(臭氧水)對鯧魚塊進行處理后,貨架期比對照組延長了11 d;裘帥波等[58]則采用生物保鮮劑(0.5 g/L乳酸菌肽)使青占魚的貨架期延長了4~5 d。但實際應用中單一的保鮮處理難以達到理想的保鮮效果,因此柵欄技術在控制魚源SSOs的應用成為了研究重點。例如Gao等[59]利用生物抗氧化劑(迷迭香)和生物抗菌劑(Nisin)處理鯧參魚,使其在4 ℃貯藏的貨架期較空白延長了6d;藍蔚青等[11]利用殼聚糖、茶多酚和溶菌酶等配制的復合保鮮劑對帶魚處理后有氧貯藏,對微生物群落結構分析表明:冷藏帶魚中的SSOs希瓦氏菌與熒光假單胞菌受到明顯抑制,其對嗜冷桿菌與其他假單胞菌的抑制效果也較顯著,處理組的貨架期較空白組延長了1倍。
4 展 望
建立嚴格的SSOs的確定方法并對其進行生長預測,對于了解不同條件下魚類腐敗特性,延長魚類產品的貨架期具有很好的參考價值。目前,我國在SSOs的確定中傳統(tǒng)鑒定方法應用較多,SSOs的腐敗能力研究還不夠深入,微生物預測模型多停留于已有模型的應用。由于原材料和加工流通條件的復雜性,如何在SSOs的生長預測模型的建立時更好地考慮實際環(huán)境(波動溫度、多環(huán)境因子等)及模型的優(yōu)化同樣具有現(xiàn)實意義。同時在未來SSOs的研究中還應注重多方法聯(lián)用來確定SSOs,深入分析SSOs的腐敗機理,開發(fā)更有效的SSOs控制新技術。
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