姚丹靜 曲弈 陳金慧

摘要：為探索脯氨酸在杉木胚性愈傷組織超低溫冷凍保存過程中的作用，本試驗(yàn)以繼代14 d的杉木愈傷組織為材料，在預(yù)處理階段設(shè)置不同濃度的脯氨酸，采用TTC法測(cè)定相應(yīng)的細(xì)胞存活率。結(jié)果表明：預(yù)處理階段，脯氨酸濃度為05 g·L1時(shí)，細(xì)胞存活率相對(duì)最高。說明了在預(yù)處理階段添加適宜濃度的脯氨酸可提高超低溫冷凍保存的存活率。

關(guān)鍵詞：脯氨酸；超低溫冷凍保存；杉木；胚性愈傷組織

中圖分類號(hào)：S722.3+7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1004-3020（2014）03-0030-03

The Influence of Prolin on Cryopreservation of Callus of Cunninghamia lanceolata

Yao DanjingQu YiChen Jinhui

（College of Forest Resources and Environment，Nanjing Forestry UniversityNanjing210037 ）

Abstract： To explore the role of prolin in the process of cryopreservation of embryogenic callus of Cunninghamia lanceolata，the cell survival of 14 days callus of Cunninghamia lanceolata of subculture was measured by the TTC method with different concentrations of proline in the pretreatment stage.The result showed that： in the pretreatment stage， when the concentration of proline was 0.5 g·L1，the cell survival was relatively the highest.It suggested that adding suitable concentration of proline in the pretreatment stage can improve the survival of cryopreservation.

Key words：prolin；cryopreservation；Cunninghamia lanceolata；embryogenic callus

杉木Cunninghamia lanceolata是我國(guó)特有的速生商品材樹種，被廣泛應(yīng)用于木材和藥用方面。目前利用杉木成熟合子胚能成功實(shí)現(xiàn)體胚發(fā)生 [1 ]，但是經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的繼代培養(yǎng)，體胚發(fā)生的能力會(huì)逐漸降低直至喪失。將超低溫冷凍保存技術(shù)和杉木胚性愈傷組織培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合起來，能長(zhǎng)期保存植物材料并保證其遺傳穩(wěn)定性，可有效解決杉木胚性愈傷組織體胚發(fā)生能力衰退的問題 [2 ]。同時(shí)，脯氨酸可以提高植物對(duì)低溫的耐受性 [3，4 ]，其在穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、降低細(xì)胞酸性、解除氨毒以及作為能量庫(kù)調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原勢(shì)等方面有著重要作用；另外還能作為植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、降低凝固點(diǎn)，防止細(xì)胞脫水 [5 ]。本試驗(yàn)在已研究的杉木胚性愈傷組織超低溫冷凍保存技術(shù)的基礎(chǔ)上，探討在預(yù)處理階段，不同濃度的脯氨酸對(duì)杉木胚性愈傷組織超低溫冷凍結(jié)果的影響。

1材料與方法

本試驗(yàn)采用玻璃化冷凍法 [6 ]，對(duì)杉木胚性愈傷組織進(jìn)行超低溫冷凍保存。

1.1試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)的胚性愈傷組織為起始材料，對(duì)經(jīng)過14 d繼代培養(yǎng)的材料進(jìn)行超低溫冷凍保存試驗(yàn)。

1.2試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)在預(yù)處理階段設(shè)置不同濃度的脯氨酸，每個(gè)濃度設(shè)置3組重復(fù)，取預(yù)培養(yǎng)20 d與復(fù)蘇階段的杉木胚性愈傷組織，測(cè)定細(xì)胞相對(duì)存活率。

1.2.1杉木愈傷組織繼代培養(yǎng)

杉木胚性愈傷組織在改良的DCR培養(yǎng)基上能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定增殖，具有體胚發(fā)生的能力。繼代培養(yǎng)基為DCR+VC 10 mg·L1+2，4-D 10 mg·L1+BA 05 mg·L1+KT 05 mg·L1，谷氨酰胺045 g·L1，肌醇01 g·L1，水解酪蛋白05 g·L1，活性炭25 g·L1，水晶洋菜24 g·L1，麥芽糖20 g·L1，pH53。在23 ℃下暗培養(yǎng)，每25 d為1個(gè)繼代周期。

1.2.2杉木愈傷組織超低溫冷凍保存

（1）預(yù)培養(yǎng)：杉木胚性愈傷組織在不含激素的DCR固體培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，23 ℃暗培養(yǎng)21 d。

（2）預(yù)處理：杉木胚性愈傷組織在添加05 mol·L1山梨醇的高滲固體培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)處理，添加不同濃度的脯氨酸（濃度0，05，10，20 g·L1），23 ℃暗培養(yǎng)5 d。

（3）冷凍方法：無(wú)菌條件下，將預(yù)處理后的杉木胚性愈傷組織放入18 mL冷凍管，每管05～06 g，加入冷凍液（含06 mol·L1山梨醇+10%DMSO的液體培養(yǎng)基），在冰上預(yù)冷20 min后吸去冷凍液，再次加入冷凍液，將冷凍管放入程序降溫儀以-1 ℃/min 的速率梯度降溫至-90 ℃，于液氮中保存，至少2 d以后進(jìn)行解凍復(fù)蘇。

（4）解凍與洗滌：將冷凍2 d以上的杉木胚性愈傷組織從液氮罐中取出，置于37 ℃水浴鍋中解凍2 min，化凍后即用復(fù)蘇液（含07 mol·L1山梨醇的液體培養(yǎng)基）洗滌3次。

（5）復(fù)蘇與再培養(yǎng)：將解凍后的杉木胚性愈傷組織接種到含04 mol·L1山梨醇的固體培養(yǎng)基中，23 ℃暗培養(yǎng)2 d；2 d后，再將其接種到含02 mol·L1山梨醇的固體培養(yǎng)基中，23 ℃暗培養(yǎng)2 d。

（6）細(xì)胞生活力的測(cè)定：采用TTC法 [7 ]測(cè)定細(xì)胞存活率。稱取100 mg待測(cè)材料，加15 mL04%TTC溶液，15 mL磷酸緩沖液（pH7，01 mol·L1），靜置于23 ℃暗處。21 h后去上清液，加入5 mL蒸餾水洗滌細(xì)胞，重復(fù)3次。加入5 mL 95%乙醇，置于60 ℃水浴中30 min，期間輕輕搖動(dòng)1～2次，靜置于室溫下至細(xì)胞無(wú)色。取上清液，在分光光度計(jì)485 nm處測(cè)吸光值。用相對(duì)存活率表示細(xì)胞的活力。

細(xì)胞相對(duì)存活率= 解凍后細(xì)胞TTC值未冷凍細(xì)胞TTC值×100%

2結(jié)果與分析

2.1杉木胚性愈傷組織超低溫冷凍保存過程的生長(zhǎng)狀況

繼代14 d的杉木胚性愈傷組織外觀呈白色，細(xì)胞飽滿含水豐富（圖1A）；經(jīng)預(yù)培養(yǎng)18 d后，杉木胚性愈傷組織顏色偏黃，略有失水現(xiàn)象（圖1B）；預(yù)處理4 d，細(xì)胞呈黃褐色，高滲透壓使愈傷組織出現(xiàn)了明顯的失水現(xiàn)象，細(xì)胞質(zhì)濃縮，該狀態(tài)有利于冷凍（圖1C）；高滲復(fù)蘇3 d的杉木胚性愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，沒有新愈傷組織出現(xiàn)（圖1D）；復(fù)蘇27 d的杉木胚性愈傷組織長(zhǎng)出新愈傷組織（圖1E）； 冷凍后恢復(fù)繼代培養(yǎng)的杉木胚性愈傷組織與未經(jīng)過冷凍處理的杉木胚性愈傷組織相比，含水量較多，刺狀結(jié)構(gòu)較少，愈傷組織細(xì)胞較為黏稠（圖1F）。

圖1杉木胚性愈傷組織各階段的狀態(tài)

A.繼代培養(yǎng)的杉木胚性愈傷組織；B.預(yù)培養(yǎng)18 d的杉木胚性愈傷組織；C.預(yù)處理4 d的杉木胚性愈傷組織；D.高滲復(fù)蘇3 d的杉木胚性愈傷組織；E.復(fù)蘇27 d的杉木胚性愈傷組織；F.恢復(fù)繼代培養(yǎng)的杉木胚性愈傷組織。

2.2脯氨酸濃度對(duì)杉木胚性愈傷組織存活率的影響

取預(yù)培養(yǎng)20 d與復(fù)蘇階段的杉木胚性愈傷組織，經(jīng)過處理后，測(cè)其在分光光度計(jì)485 nm處的吸光值，通過公式計(jì)算，將細(xì)胞相對(duì)存活率繪制成圖2。

在預(yù)處理階段，添加不同濃度的脯氨酸對(duì)杉木胚性愈傷組織存活率有一定影響。由圖2可以看出，當(dāng)預(yù)處理階段脯氨酸濃度為05 g·L1時(shí)，細(xì)胞存活率相對(duì)最高。

3討論

目前，許多關(guān)于植物愈傷組織的超低溫冷凍保存研究都已見報(bào)道，但少有人研究脯氨酸對(duì)植物愈傷組織超低溫冷凍保存的影響。本試驗(yàn)在已研究的杉木胚性愈傷組織的超低溫冷凍保存技術(shù)的基礎(chǔ)上，探討脯氨酸在其過程中的作用。試驗(yàn)在預(yù)處理階段添加不同濃度的脯氨酸，以探求最適宜的脯氨酸濃度，使得冷凍后存活率更高。試驗(yàn)結(jié)果表明：在預(yù)處理階段，脯氨酸濃度為05 g·L1時(shí)，細(xì)胞存活率相對(duì)最高。另外，通過試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過預(yù)處理的杉木胚性愈傷組織明顯失水，細(xì)胞質(zhì)均高度濃縮，該狀態(tài)有利于超低溫冷凍保存，由此可見預(yù)處理是促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)濃縮較為關(guān)鍵的一步。

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（責(zé)任編輯：鄭京津）