沈銳　張金明　張鳳剛等

[摘要]目的：探討燒傷后增生性瘢痕患者血清中TGF-β、VEGF濃度變化及意義。方法：選擇2009，8～2011，8我科住院的燒傷后增生性瘢痕患者共74例，根據(jù)創(chuàng)面愈合后瘢痕增生時(shí)間長(zhǎng)短分組，分為4組，選擇12例正常人作為正常對(duì)照組，共5組。用酶聯(lián)吸附法（ELISA）檢測(cè)患者血清中TGF-β、VEGF的濃度，5組之間統(tǒng)計(jì)比較分析。結(jié)果：瘢痕患者血清中TGF-β、VEGF含量與瘢痕增生時(shí)段關(guān)系密切，1～3月早期瘢痕組血清中TGF-β、VEGF含量開始增加，隨瘢痕的發(fā)展升高，4～6個(gè)月瘢痕組血清中TGF-β、VEGF含量達(dá)到了高峰。隨著瘢痕成熟，TGF-β、VEGF濃度又逐漸下降。結(jié)論：燒傷后增生性患者血清中TGF-β、VEGF的含量可較好地反映增生性瘢痕代謝活躍程度，是增生性瘢痕增生活躍程度敏感的標(biāo)記物。

[關(guān)鍵詞]增生性瘢痕；燒傷后；血清；標(biāo)記物；TGF-β；VEGF

[中圖分類號(hào)]R619+.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2014）04-0292-03

增生性瘢痕（Hypertrophic scar， HS）是以膠原纖維等細(xì)胞外基質(zhì)過度生成、沉積為特征的皮膚纖維化疾病 [1]。臨床治療方法多樣，但是缺乏十分有效的治療手段。另外，目前臨床上尚缺乏一種準(zhǔn)確、可重復(fù)評(píng)價(jià)瘢痕增生程度的指標(biāo)，不利于抗瘢痕藥物與方法的療效評(píng)價(jià)、優(yōu)化與篩選，也深刻影響著瘢痕治療的進(jìn)展。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（Transforming growth factorβ，TGF-β）與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前研究得比較透徹的，對(duì)瘢痕增生起明顯促進(jìn)作用的細(xì)胞因子，兩因子均可在瘢痕組織局部表達(dá)、分泌，其表達(dá)的量甚至與瘢痕增生的程度密切相關(guān)[2-5]。那么這兩種瘢痕形成促進(jìn)因子是否能夠分泌入血液，能不能通過檢測(cè)燒傷后瘢痕患者血液中TGF-β、VEGF兩因子的濃度來評(píng)價(jià)瘢痕增生的程度，該實(shí)驗(yàn)在這方面進(jìn)行了有益的探索。

1 對(duì)象和方法

1.1 病例及標(biāo)本的選擇：選擇2009，8～2011，8期間，我燒傷整形外科住院的燒傷后瘢痕患者74例，分屬于瘢痕增生的不同時(shí)期。其中男49例，女25例，最大年齡55歲，最小年齡18歲，平均年齡為（27.9±13.4）歲，所有受試者均無妊娠，無罹患其它結(jié)締組織疾病，亦無其它影響檢測(cè)結(jié)果的局部或全身性疾病，為了減少瘢痕面積對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，規(guī)定瘢痕面積均不得大于體表面積的10%。另選12例健康人群作為正常對(duì)照組，所采取的檢測(cè)均獲得受試者或其家屬知情同意，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。74例瘢痕患者根據(jù)創(chuàng)面愈合后瘢痕增生的不同時(shí)段分組，分為4組： ①1～3月的早期瘢痕組；②4～6月的瘢痕組；③7～12月的瘢痕組：④1年以上的接近成熟期的增生性瘢痕組。與正常對(duì)照組一起，共為5組。檢測(cè)其血清中TGF-β、VEGF的濃度的水平。

1.2 主要試劑和儀器：試劑盒來自于北京生物技術(shù)研究所，其它為常用試劑。采用生物素雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）對(duì)標(biāo)本血清中TGF-β、VEGF含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的制備：抽取靜脈血2ml，置干燥管，室溫下靜置3h，在3000rpm離心機(jī)內(nèi)離心，離心15min。用移液管移取血清0.5ml，置于離心管，標(biāo)本放于-70℃超低溫冰箱內(nèi)保存，待標(biāo)本收集完成后，對(duì)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本統(tǒng)一進(jìn)行檢測(cè)，以避免不同批次實(shí)驗(yàn)試劑和實(shí)驗(yàn)操作人員對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

1.4 用ELISA試劑盒對(duì)血清中TGF-β、VEGF的濃度進(jìn)行檢測(cè)：標(biāo)本解凍。標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋。根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量決定所需的板條數(shù)。加樣：①空白管對(duì)照孔不加樣品、生物素標(biāo)記的抗TGF-β1抗體以及鏈霉素親和素-HRP，只加顯色劑A&B和終止液，其余操作相同；②標(biāo)準(zhǔn)品孔：加入標(biāo)準(zhǔn)品50μg，鏈霉素親和素-HRP（標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好生物素抗體，故不加）；③待測(cè)樣品孔：加入樣本40μl，然后各加入抗TGF-β1抗體10μl、鏈酶親和素-HRP，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37℃溫育60min。配液、洗滌、顯色、終止按試劑盒要求操作。最后測(cè)定：用空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度以及對(duì)應(yīng)OD值計(jì)算出保準(zhǔn)曲線的直線方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。

1.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件13.0進(jìn)行分析。P<0.05認(rèn)為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，創(chuàng)面愈合后1～3月瘢痕組血清中TGF-β、VEGF的濃度已有升高。4～6月瘢痕組達(dá)到了最高水平，但隨著增生性瘢痕的逐漸成熟，到瘢痕趨向成熟時(shí)（1年以后瘢痕），TGF-β、VEGF的濃度又明顯下降，但仍未恢復(fù)到正常水平，見表1。

3 討論

增生性瘢痕形成與皮膚損傷程度相關(guān)，可發(fā)生在身體任何部位，多見于嚴(yán)重?zé)齻?、擦傷、撕脫傷等等[6]。增生性瘢痕形成后，其外在表現(xiàn)實(shí)際上處在不斷演進(jìn)之中，早期瘢痕顏色鮮紅，質(zhì)地韌，明顯突出于正常皮膚平面，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，瘢痕逐漸成熟，顏色變淺，質(zhì)地變軟，表面充血的血管亦不復(fù)存在。據(jù)此，臨床上可以根據(jù)肉眼觀察與簡(jiǎn)單的檢查，如根據(jù)瘢痕顏色、硬度、厚度、瘢痕攣縮程度及其它伴隨癥狀，如有無痛、癢癥狀等指標(biāo)就可以評(píng)判瘢痕增生程度，方便指導(dǎo)臨床瘢痕的診療工作，也可將這些瘢痕簡(jiǎn)單的指標(biāo)制成量表來規(guī)范應(yīng)用，其中著名的是溫哥華瘢痕量表（Vancouver scar scale， VSS），該方法優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、易行，缺點(diǎn)是存在著一定主觀性和隨意性，臨床應(yīng)用上存在一定爭(zhēng)議，臨床上，尋找更為客觀的指標(biāo)來評(píng)價(jià)瘢痕增生程度實(shí)屬必要[7]。

瘢痕是創(chuàng)傷的過度愈合，瘢痕形成與瘢痕局部細(xì)胞因子及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異?；罨P(guān)系密切[8]。TGF-β直接地通過促進(jìn)瘢痕組織內(nèi)成纖維細(xì)胞增殖以及合成膠原纖維，而VEGF通過促進(jìn)瘢痕內(nèi)部大量的血管增生，為瘢痕增生提供充分的氧氣、營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，間接地促進(jìn)瘢痕膠原合成，兩細(xì)胞因子均能明顯地促進(jìn)瘢痕增生與形成[9]。但是瘢痕促進(jìn)因子TGF-β、VEGF瘢痕組織表達(dá)后能否分泌入血，瘢痕患者血液中TGF-β與VEGF的濃度變化與瘢痕增生時(shí)段之間的關(guān)系是否密切， TGF-β、VEGF兩因子是否可以作為評(píng)價(jià)瘢痕增生程度的標(biāo)記物，國(guó)、內(nèi)外尚未見這方面的報(bào)道[7，10]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同時(shí)期的瘢痕組織合成的TGF-β、VEGF能夠入血全身分布，表現(xiàn)為患者血清中TGF-β、VEGF的濃度不同程度的升高，兩因子的濃度變化與瘢痕臨床演進(jìn)過程基本一致。1～3月早期瘢痕組患者血清中TGF-β、VEGF開始升高，臨床表現(xiàn)為瘢痕開始增生，4～6月瘢痕組患者血清中TGF-β、VEGF的濃度達(dá)到了最高水平，這時(shí)瘢痕增生最為嚴(yán)重。隨著，7～12月瘢痕組患者血清中TGF-β、VEGF的濃度又逐漸下降，以至于1年以后瘢痕組TGF-β、VEGF的濃度趨向于正常（但是不能達(dá)到正常水平），臨床表現(xiàn)為瘢痕逐漸趨向成熟。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：燒傷創(chuàng)面愈合后，創(chuàng)面愈合調(diào)控因子異常上升，是致使燒傷后增生性瘢痕形成重要原因，同時(shí)患者血清中TGF-β、VEGF是評(píng)價(jià)瘢痕增生的理想標(biāo)記物。

相對(duì)于溫哥華瘢痕量表，增生性瘢痕患者血清中TGF-β、VEGF的濃度變化能夠更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)瘢痕組織膠原代謝情況以及反映患者瘢痕增生情況，可以作為評(píng)價(jià)燒傷后增生性瘢痕增生程度較為敏感的、客觀的標(biāo)記物。缺點(diǎn)是需要患者抽血檢查，具有一定的創(chuàng)傷，實(shí)驗(yàn)檢查和結(jié)果之間有一定的時(shí)間差，同時(shí)瘢痕患者血清中TGF-β、VEGF的濃度變化不但與瘢痕時(shí)段有關(guān)，也與瘢痕面積大小等因素相關(guān)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性可能受到干擾，臨床應(yīng)用時(shí)尚需進(jìn)一步完善。如兩種方法結(jié)合使用，可彌補(bǔ)兩者的各自不足。

瘢痕疙瘩局部切除后復(fù)發(fā)率極高，有學(xué)者提出假說，認(rèn)為在瘢痕疙瘩在形成以前，有典型的損傷后潛伏（有時(shí)原發(fā)損傷不明顯而被患者忽略），如果第二次觸發(fā)（例如單純的外科切除），則會(huì)很快復(fù)發(fā)，病變常常較前增大。該特點(diǎn)可比作一個(gè)免疫反射弧：最初的接觸導(dǎo)致致敏階段、記憶形成和效用機(jī)制。瘢痕疙瘩形成的第二階段類似于第二次免疫反應(yīng)。但是該假說沒能找到答案[11]。有趣的是，在臨床工作中，為嚴(yán)重瘢痕患者實(shí)行植皮手術(shù)時(shí)，其遠(yuǎn)離瘢痕局部供皮區(qū)瘢痕增生往往較明顯，令人困惑。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可能有助于解釋這些假說與現(xiàn)象，我們的推測(cè)：瘢痕或瘢痕疙瘩局部組織表達(dá)、分泌過量的瘢痕TGF-β、VEGF，并分泌入血全身分布，如果其他部位新添創(chuàng)傷或手術(shù)，那么創(chuàng)傷或手術(shù)局部組織液體中TGF-β、VEGF的濃度因疊加效應(yīng)勢(shì)必較高，瘢痕增生可能異常明顯。介導(dǎo)瘢痕疙瘩“免疫反應(yīng)”的不是抗體，而可能是血液中高濃度的瘢痕促進(jìn)因子TGF-β、VEGF。因此，我們可將身體有增生性瘢痕或瘢痕疙瘩存在看成一種“獲得的”的“瘢痕體質(zhì)”，可能對(duì)身體其他部位再發(fā)損傷形成的繼發(fā)瘢痕產(chǎn)生不利影響。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Pitzer GB，Patel KG. Proper care of early wounds to optimize healing and prevent complication[J]. Facial Plast Surg Clin North Am，2011，19（3）：491-504.

[2]Honardoust D，Varkey M，Marcoux Y.Reduced decorin，fibromodulin，and transforming growth factor-[beta]3 in deep dermis leads to hypertrophic scarring[J].J Burn Care & Res，2012，33（2）：218-227.

[3]Mogili NS，Krishnaswamy VR，Jayaraman M，et al. Altered angiogenic balance in keloids： a key to therapeutic intervention[J].Transl Res，2012，159：182-189.

[4]Steinbrech DS，Mehrara BJ，Chau D，et al.Hypoxia upregulates VEGF production in keloid fibroblasts[J].Ann Plast Surg，1999，42：514-519；discussion 519.

[5]Wilgus TA，F(xiàn)erreira AM，Oberyszyn TM，et al.Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor[J].Lab Invest，2008，88：579-590.

[6]Yang JY，Yang SY.Are auricular keloids and persisitent hypertrophic scars resectable？ The role of intrascar excision[J]. Ann Plast Surg，2012，69：637-642.

[7]Perry DM， McGrouther DA， Bayat A. Current tools for noninvasive objective assessment of skin scars[J]. Plast Reconstr Surg，2010，126：912-923.

[8]Matthew RJ， Gautam GS，Joseph PA ，et al. Novel therapies for scar reduction and regenerative healing of skin wounds[J]. Trends Biotechnol，2008，4（26）：173-180.

[9]沈銳，利天增.組織缺氧與增生性瘢痕的關(guān)系[J].國(guó)際外科學(xué)雜志，2006，33（1）：70-73.

[10]Duncan JA， Bond JS， Mason T， et al. Visual analogue scale and ranking： a suitable and sensitive method for assessing quality[J].Plast Reconstr Surg， 2006；118（4）：909-918.

[11]王煒.整形外科學(xué)[M].杭州：浙江科學(xué)技術(shù)出版社，1999：428.

[收稿日期]2013-12-08 [修回日期]2014-01-22

編輯/張惠娟