李海林 李維國 楊朝渠

摘 要 利用MSAP技術，檢測橡膠樹熱研8-79幼態(tài)無性系與老態(tài)無性系DNA甲基化差異。結果表明，幼態(tài)無性系的DNA甲基化水平為33.2%，老態(tài)無性系的DNA甲基化水平為22.9%，兩者基因組DNA甲基化水平有一定差異，而且DNA甲基化模式也不同。對部分差異片段經(jīng)同源性比對分析可知，同源序列的功能主要與代謝、細胞生長相關。這些差異可能是導致橡膠樹幼態(tài)與老態(tài)無性系間性狀差異的原因。

關鍵詞 橡膠樹；幼態(tài)無性系；老態(tài)無性系；MSAP

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

MSAP Analysis of Juvenile Clones and Mature

Clones of Hevea brasiliensis

LI Hailin1， LI Weiguo2，3 *， YANG Zhaoqu1

1 Horticulture Department， Taizhou Vocational College of MSAP technologyScience and Technology， Taizhou， Zhejiang 318020， China

2 State Center for Rubber Breeding， Insitute of Rubber， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou， Hainan

571737， China

3 College of Agronomy，Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract The genomic DNA methylation of Hevea brasiliensis was comparatively studied with MSAP based on juvenile clones and mature clones. The results showed that the DNA methylation level of the juvenile clones was 33.2%， while that for the mature clones was 22.9%. Furthermore， the DNA methylation patterns were also different. Homology analysis for some fragment of difference revealed that the main function of homologous sequences was related eith metabolism and cell growth.

Key words Rubber； Juvenile clone； Mature clone； MSAP

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.001

橡膠樹（Hevea brasiliensis）為大戟科高大喬木，在生產上，為了保持母本的優(yōu)良性狀，一般通過嫁接的方式繁殖。根據(jù)接穗取自母樹生長部位的差異，接成的芽接苗分為幼態(tài)無性系和老態(tài)無性系[1]。從理論上說，嫁接是無性繁殖，不會導致遺傳信息改變。嫁接法繁殖的后代，一般能保持母本原有性狀。但是，國內外學者發(fā)現(xiàn)，橡膠樹幼態(tài)無性系比同源的老態(tài)無性系產量高，長勢好，抗逆性強[1-3]。為了研究橡膠樹幼態(tài)無性系增產的分子機理，本研究利用MSAP技術從表觀遺傳學角度探索橡膠樹無性系之間性狀差異的原因。表觀遺傳學（epigenetics）是指在DNA序列沒有發(fā)生改變的情況下，基因功能發(fā)生了可遺傳的遺傳信息變化[4]。DNA甲基化是表觀遺傳學研究最深入、最重要的一種機制，已經(jīng)成為當前分子生物學研究的熱點。作為檢測DNA甲基化的主要方法，MSAP（Methylation sensitive amplified polymorphism）即甲基化敏感擴增多態(tài)性，具有一次性檢出位點多的特點，而且分析結果直接與基因序列聯(lián)系起來，已成為檢測植物基因組DNA甲基化的重要方法，并且已經(jīng)應用在臍橙[5]、松樹[6]、馬占相思[7]、枇杷[8]等木本植物的基因組DNA甲基化研究中。李海林等[9-10]通過建立了橡膠樹的MSAP反應體系，對橡膠樹的MSAP進行了初步分析。本研究是在之前研究的基礎上，利用MSAP技術分析橡膠樹幼態(tài)與老態(tài)無性系間基因組DNA甲基化水平和模式的差異，探索DNA甲基化差異對橡膠樹生長發(fā)育的調控機理，為進一步深入研究橡膠樹幼態(tài)無性系高產的原因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 選取橡膠樹熱研8-79幼態(tài)無性系和老態(tài)無性系展葉期健康葉片，采自中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所基地。

1.1.2 試劑 EcoRⅠ、HpaⅡ、MspⅠ、dNTP、RNase、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶等為Fermentas公司產品；Tris、CTAB、EDTA、PVP、β-巰基乙醇、葡萄糖、分子量標準（Marker）均購自上海高科生物工程有限公司；TEMED、尿素、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺為BBI公司進口分裝；硝酸銀購自上海生工生物工程有限公司；剝離硅烷、親和硅烷購自北京昌盛鼎國生物技術有限公司；其它試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 MSAP MSAP包括DNA的提取、酶切、連接、預擴增、選擇性擴增、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染檢測。具體流程參照李海林等[9]的報道。接頭和引物序列參見表1。

1.2.2 帶型分析 HpaⅡ和 MspⅠ分別與EcoRⅠ組合進行MSAP反應時，每一個擴增位點均代表一個（CCGG/GGCC）位點，有帶則計x 對MSAP擴增產物的電泳清晰條帶進行統(tǒng)計，根據(jù)EcoRⅠ+HpaⅡ和EcoRⅠ+MspⅠ擴增條帶的差異，分別統(tǒng)計幼態(tài)無性系與老態(tài)無性系基因組DNA甲基化水平（即總甲基化率，包括全甲基化率和半甲基化率）。再根據(jù)兩者在同一位點甲基化的差異，分析二者之間DNA甲基化模式的差異。

1.2.3 差異位點回收、克隆、測序、序列比對、功能分類 將甲基化修飾位點用刀片切下，100 μL滅菌雙蒸水沸水浴5 min。取2 μL上清液為擴增模板，以相應選擴引物及擴增條件進行擴增。PCR 產物進行回收、連接、轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑陽性單克隆。序列測定委托華大基因（深圳）科技股份有限公司完成。所得序列用BLASTN程序在 NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）上進行同源性檢索，同源序列功能分類按照Bevan等[11]的方法分類。

2 結果與分析

2.1 DNA甲基化水平差異分析

25對引物擴增結果中，選擇擴增條帶清晰、多態(tài)性好的16對引物進行擴增結果統(tǒng)計分析，結果見表2。由表2可知，16對引物擴增總片段數(shù)為550條，其中幼態(tài)無性系262條，老態(tài)無性系288條。幼態(tài)無性系中：半甲基化帶數(shù)32條，半甲基化水平為12.2%；全甲基化帶數(shù)55條，全甲基化水平為21.0%。甲基化帶數(shù)共87條，總甲基化水平33.2%。老態(tài)無性系中：半甲基化帶數(shù)19條，半甲基化水平為6.6%；全甲基化帶數(shù)47條，全甲基化水平為16.3%。甲基化帶數(shù)共66條，總甲基化水平22.9%。二者相比，幼態(tài)無性系的半甲基化水平、全甲基化水平和總甲基化水平要高于老態(tài)無性系。

2.2 DNA甲基化模式差異分析

2.3 MSAP差異條帶測序

對部分回收、克隆后得到的差異序列，通過比對后，同源序列是一些基因組序列。按照功能注釋進行劃分，差異序列的功能主要分為：代謝、細胞生長、細胞結構、不明確分類等（表4）。

3 討論與結論

幼態(tài)無性系和老態(tài)無性系的全甲基化水平都比半甲基化水平高。由此推斷，橡膠樹基因組中甲基化的模式主要是以全甲基化為主，也就是以DNA雙鏈內側胞嘧啶（Cm5CGG）甲基化為主。這與枇杷[8]、油菜[13]的一致，和臍橙[5]的相反。說明不同植物基因組中甲基化的主要模式是不同的。此外，和老態(tài)無性系相比，幼態(tài)無性系DNA甲基化水平和模式都存在差異。模式的差異主要通過重新甲基化和去甲基化而引起。

通過對二者DNA甲基化差異條帶測序和分析可知，這些序列的功能與代謝、細胞生長、細胞結構有關。差異條帶DNA甲基化的變化是否導致橡膠樹幼態(tài)與老態(tài)無性系性狀的差別，需要進一步深入研究。

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