汪思遠等

摘 要：細胞色素P450（CYP450）是動植物及微生物體內一類超基因家族編碼的單加氧酶，參與多種催化反應，在生物防御方面具有重要作用。近年來，利用現(xiàn)代生物技術和新一代測序手段及生物信息學分析方法，對參與相關生物代謝合成途徑中的CYP450進行了分離、篩選及功能鑒定，進一步闡明了CYP450在植物體內相關代謝途徑中的催化機制。本文對植物細胞色素P450（CYP450）基因的分離，在皂苷生物合成、苯丙烷類物質代謝和芥子油苷及IAA生物合成中的功能和表達，以及在人工合成物質的解毒功能及應用等方面的研究做了簡要綜述。

關鍵詞：細胞色素P450 植物次生代謝 表達調控

Research Process of Cytochrome P450 in Plant

WANG Si-yuan，JIANG Shi-cui，WANG Kang-yu，WANG Yi，ZHANG Mei-ping

（Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Abstract：Cytochrome P450s are a diverse array of mixed-function oxidas in animal，plant and bacteria which consist of a gene superfamily.They play an important role in preventing the plants from injury by catalyzing many kinds of reactions.Several candidate CYP450s that might be involved in ginsenoside biosynthesis have been discovered，screening and functional identification by the modern biotechnology and next generation sequencing technology and bioinformatic analysis in previous studies，further elucidate in the relevant CYP450 catalytic mechanism of metanolic pathways in plants.This article summarized gene isolation，function and expression of ginsenoside biosynthesis pathway briefly，phenylpropanoid metabolic pathway and glucosinolates and IAA biosynthesis pathway，and research in the detoxification function and application of synthetic substances.

Key words：Cytochrome P450，Plant secondary metabolism，Expression regulation、

細胞色素P450（cytochrome P450，簡稱P450）是一類以血紅素為輔基的B族細胞色素超家族蛋白酶，是血紅素蛋白大家族中極其重要的一員，通常與內質網(wǎng)、線粒體、質體、高爾基體等細胞器膜結合，分布在生命進化過程中的所有分支。之所以命名為P450是因為還原態(tài)P450與一氧化碳結合后在450nm處有一吸收峰。因其能插入一個氧原子到疏水性分子而使它們變得更具有活性或者親水性，所以又被稱為單加氧酶（mixed-function oxidase，簡稱MFO）[1]。最早于1958年在大鼠肝微粒體中被發(fā)現(xiàn)。1969年，D.S Frear首次在植物（棉花）中發(fā)現(xiàn)了它的存在。至此之后，大量的研究報道表明在包括小麥[2]、蓖麻[3]等許多植物中也均有P450的出現(xiàn)。細胞色素P450作為植物中最大的家族蛋白在植物體內起著重要作用。

隨著細胞色素P450的蛋白組成及結構等生化特性日趨明朗，研究學者們逐步將研究方向轉移到它所參與的生物體內相關代謝途徑和催化反應等方面。那么，利用現(xiàn)代生物技術手段，越來越多的CYP450被成功的克隆分離及外源表達，這大大加快了闡明植物次生代謝途徑機制及關鍵酶基因功能的研究進展。本文就目前CYP450研究的現(xiàn)狀，著重對近年來CYP450的分離及其在所參與的生物合成代謝途徑中的功能和表達的研究進展進行了綜述。

1 植物細胞色素P450的分類

P450基因是一個古老的超基因家族，通常根據(jù)基因編碼氨基酸序列的相似性及系統(tǒng)進化關系對P450進行分類和命名。在試圖確定新發(fā)現(xiàn)的P450基因與已知P450基因是否為同一家族時，主要看二者氨基酸序列比對時一致性的比例，若大于40%則它們屬于同一個家族，否則屬于一個新的家族；若大于40%但小于55%，則它們屬于同一家族的兩個不同的亞家族；若大于55%，則它們屬于同一亞家族。其等位基因氨基酸序列的同源性不小于97%[4]。植物的第一個P450cDNA是CYP71A1，這是1990年由Bozak，K.R.，Yu.H.[5]等在鱷梨中分離的和成熟相關的基因。陸生植物細胞色素P450可分為11個簇（clans），歸為2類：單家族簇（CYP51、CYP74、CYP97、CYP710、CYP711、CYP727、CYP746）和多家族簇（CYP71、CYP72、CYP85、CYP86）[6]。研究表明，所有生物細胞色素P450分子之間都具有一定的序列保守性，即細胞色素P450具有不同物種間的同源性，這種同源性表明它們都起源于同一個共同的祖先。那么根據(jù)所有已知結構的細胞色素P450基因的特點，將結構中存在保守FxxGxRxCxG序列的血紅素結合域（Heme-binding region），作為鑒定P450的主要特征。

2 植物細胞色素P450基因的分離

隨著人們對植物基因組研究深度和廣度的提高，近年來，研究人員從擬南芥、番茄、水稻、玉米、大豆等主要農(nóng)作物中分離得到的細胞色素P450基因也日益增多。植物中細胞色素P450基因的數(shù)目約占整個基因組基因數(shù)目的1%。Nelson[7]等比較分析結果表明：大多數(shù)已知的細胞色素P450基因家族，在約2億年前單子葉植物與雙子葉植物分化之前就已經(jīng)存在了。截至2009年8月，已發(fā)布了共11 294條單一細胞色素P450基因（見表1）。綜合http：//drnelson.ut mem.edu/Cytoc hrome P450.html所發(fā)表的數(shù)據(jù)。

自發(fā)現(xiàn)P450以來，隨著研究的深入人們逐步將視線鎖定在它的分離及其功能鑒定上，因P450蛋白是原核生物可溶性蛋白中的一種，其化學性質易于分離純化；而在真核生物中，它往往是通過N-端的疏水序列或者疏水環(huán)與線粒體內膜或內質網(wǎng)膜結合，因此很難分離純化，故人們一直將真核生物P450蛋白的分離作為研究的重點。1991年Durst[8]等發(fā)現(xiàn)植物P450蛋白具有以下幾個特點：含量低、不穩(wěn)定、細胞壁不易破碎、水解酶活性及干擾物質含量高，這些特點導致植物P450蛋白的分離異常困難。到目前為止，利用差異篩選法、抗體或探針篩選cDNA文庫，序列同源性等方法已成功地分離了數(shù)以萬計的細胞色素P450基因（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/），部分P450基因功能已得到鑒定[9]。

3 植物P450基因參與的生化途徑

植物細胞色素P450具有廣泛的催化活性，在植物體內催化多種初級和次級代謝反應，主要用于涉及萜類、生物堿類、甾醇類、脂肪酸、植物激素、信號分子、色素、黃酮類、異黃酮等的合成和代謝反應；以及為了使植物抵抗病蟲害和一些非生物脅迫，對部分人工合成的除草劑、殺蟲劑等進行修飾，對毒化物質進行降解，從而使植物免受毒害時參與的物質代謝[10，11]。催化作用的共同點是在底物分子中加入一個氧原子。P450蛋白質種類的多樣性和底物催化的重疊性，導致催化反應機制廣泛而復雜，如在烯基的環(huán)氧化反應、烷基的烴化作用、脫烷基作用等10多種作用中有突出體現(xiàn)。正因為CYP450具有多種功能而被人們稱為“萬能的生物催化劑”。

由于CYP450多樣而復雜，賦予不同的P450同工酶具有不同的催化機制、底物特性和反應活性，因此生物對多種物質具有代謝能力。植物細胞色素P450主要參與生物合成和生物解毒兩大類功能代謝[12，13]。

3.1 植物細胞色素P450參與的生物合成途徑

3.1.1 參與皂苷生物合成的CYP450

三萜皂苷類化合物廣泛存在于自然界中，在其生物合成的過程中，植物細胞色素P450主要催化三萜骨架惰性甲基和亞甲基的氧化[14，15]。然而，由于其催化反應的復雜性，因此關于催化機制的研究較少。近年來，隨著新一代測序技術的廣泛應用，植物基因組及轉錄組水平的測序分析工作也取得了階段性進展，篩選出了與皂苷生物合成相關的細胞色素P450，并驗證了候選基因的生物學功能， 使皂苷生物合成途徑得到了進一步闡明。

2006年Shibuya等[16]從大豆Glycinemax（L.）Merr.中鑒定了第一個參與皂苷元修飾的細胞色素P450酶CYP93E1。

燕麥根皂苷也是一類三萜化合物，分離克隆燕麥根皂苷突變體對闡明燕麥皂苷合成的通路十分必要，Qi等[17]對燕麥根皂苷缺陷突變體Sad2進行了研究，并證明它是一種可催化β-香樹脂醇轉換為燕麥根皂苷的細胞色素P450酶CYP51H10，可轉換為燕麥根皂苷。其表達僅限于根尖表皮。

目前已證實參與甘草中三萜皂苷生物合成的細胞色素P450有CYP88D6、CYP93E3和CYP72A154。與大豆中的CYP93E1一樣，CYP93E3催化β-香樹脂醇的24位羥基化，而CYP88D6具有β-香樹脂醇-11-氧化酶活性，實驗表明該酶催化β-香樹脂醇經(jīng)兩步氧化反應，先生成11α-羥基-β-香樹脂醇，再生成11-羰基-β-香樹脂醇[18]。11-羰基-β-香樹脂醇是由β-香樹脂醇到甘草酸的中間體。而從11-羰基-β-香樹脂醇到甘草酸的過程，目前已證明是由CYP72A154催化的3步氧化反應完成的，但目前尚不能完全排除在第2步和第3步氧化中其他酶的參與。在酵母中異源表達結果顯示CYP72A154催化11-羰基-β-香樹脂醇的C-30位氧化，同時，CYP72A154可能在形成不同結構甘草三萜皂苷元的過程中起到重要作用[19]。組織表達特異性分析顯示，CYP88D6在根和匍匐枝中表達，而在葉片和莖中檢測不到[18]；CYP72A154除葉片外在根、莖和匍匐枝中均有表達[25]。

Carell等[20]在蒺藜苜蓿中用激活標簽法和定向誘導基因組局部突變技術，鑒定了參與溶血皂苷生物合成的CYP716A12，YP716A12 缺陷突變體可以生成大豆皂苷，但卻不能產(chǎn)生溶血皂苷。在酵母中異源表達實驗證明，催化β-香樹脂醇C-28位氧化生成齊墩果酸。同時，實時熒光定量PCR的結果表明，CYP716A12在蒺藜苜蓿不同組織（葉、莖、根）和不同生長階段（花前期、花期、果期）的表達量為：在花期最高，在果期最低；不同生長期基因在根中的表達水平均較高，且表達量相對穩(wěn)定；在葉片中，基因表達量在生長期明顯增加，在花期達到最高值。

此外，Naoumkina等[21]通過對蒺藜苜?；蚬脖磉_聚類分析，結果表明CYP93E2參與皂苷的生物合成。鑒于其與同為豆科植物中的β-香樹脂醇-24-羥化酶CYP93E1和CYP93E3 的高度同源性，認為CYP93E2也具有β-香樹脂醇-24-羥化酶活性，但具體反應尚需實驗驗證。

在植物體內，CYP450在不同組織中的表達具有特異性，如在皂苷合成較多的根和花中的表達量明顯高于其它組織。在三萜皂苷合成代謝途徑中，像SS、FPS和DS等基因會響應MeJA 誘導表達量上調，從而使下游細胞色素P450的表達量也隨之增加[22]。結合上述兩種細胞色素P450的表達特性不難看出，將植物特定組織進行茉莉酸甲酯誘導，篩選與上游基因SS及DS 相似表達模式的CYP450，是從CYP450s家族中篩選參與人參皂苷生物合成的CYP450s的重要手段。

Sun[22]等對西洋參根進行高通量測序和生物信息學分析，用轉錄組水平最高的CYP450s進行茉莉酸甲酯誘導實驗。在根、莖、葉和花4個組織中，僅有屬于CYP716家族的contig0024轉錄本與DS表達模式一致，在系統(tǒng)進化上與擬南芥CYP88家族較近。文章把contig00248轉錄本作為氧化達瑪烷或原人參二醇的關鍵候選CYP450。

Jung等[23]和Wu等[24]分別選取人參、西洋參不同組織部位實驗，經(jīng)轉錄組測序和生物信息學分析后得出結論，人參皂苷表達有明顯的組織特異性，根中的皂苷含量明顯高于其它組織部位。Choi等人[25]采用茉莉酸甲酯處理植物材料，并對因外界刺激而使植物體內人參皂苷合成途徑中關鍵酶表達量升高的CY P450加以探索研究。2011年Han等[26]對人參不定根進行茉莉酸甲酯誘導處理，并進行轉錄組測序和生物信息學分析，得到分屬11個家族的53個CYP450s，其中CYP716A47可誘導表達量上調，將其轉入釀酒酵母中，表達的重組蛋白能催化達瑪烯二醇-Ⅱ的C-12位羥基化而使其轉化為原人參二醇。該報道首次對參與人參皂苷合成的CYP450進行了功能確證。

Luo等[38]對三七根進行高通量測序和生物信息學分析，得到174個CYP450s，從中選出轉錄組水平較高且可擴增得到全長的15個CYP450s進行聚類分析，結果表明，其中Pn00158 轉錄本的相關特性與西洋參候選CYP450 contig00248轉錄本極為相似；有7個CYP450s屬于CYP71家族，從系統(tǒng)進化關系角度分析Pn02132轉錄本與CYP93E1很近。文章認為Pn00158及Pn02132兩個轉錄本很可能是參與人參皂苷合成的候選CYP450。

2012年Han等[28]從茉莉酸甲酯誘導的人參不定根EST文庫中克隆到CYP716A53v，將其轉入釀酒酵母后表達的重組蛋白能催化原人參二醇的C-6位羥基化而使其轉化為原人參三醇。Balusamy等[29]對現(xiàn)有人參EST數(shù)據(jù)庫中全部EST序列進行去除冗余、拼接和注釋，將得到的116個預測CYP450s進行聚類分析，結果表明，預測的這些CYP450s分屬于22個家族，4個clans；同時結合組織特異性表達模式與茉莉酸甲酯誘導實驗結果，用熒光實時定量PCR方法檢測不同材料中候選CYP450的表達量，為參與人參皂苷合成途徑中的候選CYP450s提供了較全面的功能預測信息。以上關于皂苷合成相關CYP450基因的探索研究，大大促進了皂苷生物合成途徑的研究進展，同時為實現(xiàn)皂苷的體外合成提供了重要理論基礎。

迄今為止，已命名了5 100個植物細胞色素P450酶（http：//drnelson.uthsc.edu/Cytochrome P450.html）。但關于植物中CYP450基因家族的分類和功能鑒定，仍受到許多因素的限制，包括基因組信息尚不明確，用來進行轉錄組測序的材料，在選取和質量要求上沒有嚴格標準，皂苷下游合成途徑并不完全明晰，很難獲得相應的底物和產(chǎn)物等，都將制約CYP450基因的發(fā)掘速度。

3.1.2 參與苯丙烷類生物合成的P450基因

苯丙烷途徑（圖2）是植物特有次生代謝途徑，衍生于莽草酸途徑，也是植物三大次生代謝途徑之一，代謝產(chǎn)物均具有1個由苯丙氨酸合成的C6-C3骨架結構。目前，發(fā)現(xiàn)了多種經(jīng)常出現(xiàn)在苯丙烷類代謝分支途徑中關鍵步驟里的P450，包括C4H、F3H、F35H、IFS、F2H、FNSⅡ等。催化苯丙烷途徑的第2步反應的肉桂酸-4-羥化酶（Cinnamate4-hydroxylase，CHC），它是第一個被鑒定的植物CYP450單加氧酶[30]，也是第一個被克隆并確定功能的植物CYP450，迄今綠豆、菊芋等的CHC基因已被分離[31，32]。CHC對肉桂酸的催化作用具有專一性，相對于其他細胞色素P450最明顯的特點是，在植株的各個組織中均具有很高的活性。在某些植物中，它會因為組織的損傷或光照等原因而影響誘導活性；同時，因其處于催化反應的中心位置，且它參與的代謝途徑均產(chǎn)生大量的重要代謝物質，如一些植物可通過苯丙烷類代謝產(chǎn)生如木質素、丹寧等重要代謝物，因此得到了廣泛的研究。駱萍[33]在研究CYP450參與的棉酚合成過程中，分離得到2個CHC同源cDNA克隆CYP73A25和CYP73A26。經(jīng)過RT-PCR分析得出，種子中CYP73A25的表達水平很低，而在花瓣、花萼和果皮表達水平則很高；棉花的花瓣、花萼、果皮及發(fā)育種子中CYP73A26的表達水平均較高。目前，CHC基因CYP73已被成功克隆和異源表達，并且CY P71～CY P75基因也已成功地在酵母中表達[34]。

苯丙烷類生物合成途徑中的一個重要分支是可通過代謝產(chǎn)生異黃酮類物質。類黃酮3，5羥化酶（F35H）和類黃酮3羥化酶（F3H）分別通過（2S）-柚苷配基的B-環(huán)羥化作用和羥化柚皮苷和二氫山奈酚的B-環(huán)的3位置而生成的類黃酮類物質。自1987年以來，學者們利用轉基因技術，根據(jù)二者在不同物種中的控制位點不同，故在表達中產(chǎn)生花色不同的特點，在F35H和F3H可修飾花色方面做了大量的工作。

F35H作為第一個被克隆的CYP450基因已從矮牽牛、馬鞭草等植物中得到純化，主要調控花色素等物質的合成?？刂破涔δ艿腍f1和Hf2位點使花色表達偏藍。在植物中，凡缺乏F35H

基因的物種，均不能形成藍色花。但F35H并不是形成藍色花色的唯一條件[35]。

現(xiàn)已從擬南芥、矮牽牛中克隆出編碼F3H的cDNA，它在矮牽牛中的表達特性、對花色的決定性和催化特性的研究表

明[36-39]：F3H在子房、花萼、花梗、莖和花藥中均表達，但在花冠伸長時轉錄水平最高，同時，早期花瓣中F3H的轉錄水平高于發(fā)育成熟的花。研究人員從葡萄中克隆出4條F3H序列，但Southern雜交結果表明，F(xiàn)3H基因家族只有2個成員，其中F3H1

和F3H2只在根中微量表達，而F3H3和F3H4則在根、莖、葉、花和種子中均有較高水平的表達，因此認為F3H1、F3H2和F3H3、F3H4分別是兩對等位基因。

在苯丙烷類生物合成途徑中至少有16個CYP450參與催化反應，其中大多數(shù)底物和產(chǎn)物對植物都有毒害作用，因此研究整個代謝途徑中CYP450的表達和調控，有助于進一步闡明植物的分類學和進化學關系。

3.1.3 參與芥子油苷和生長素合成的P450基因

近年來，從色氨酸到芥子油苷和生長素的生物合成途徑的發(fā)現(xiàn)是植物CYP450研究取得的顯著進展之一。芥子油苷是由氨基酸衍生的天然產(chǎn)物，當組織受到損傷時，存儲在液泡中的芥子油水解為某些腈和硫氰酸等一系列復雜的防御物質，同時，芥子油苷和它的降解產(chǎn)物不僅可以作為抗癌藥物用于人體內，并且可作為作物的保護劑應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。此外，生長素作為植物生長的促進劑，在頂端優(yōu)勢、生根、維管組織的分化以及植物的熱激行為等方面均具有重要的作用。Bak[41]等研究證明（見圖2），生長素和芥子油苷的生物合成具有相同的初始底物，但IAN在生長素生物合成途徑中不是IAOx的中間產(chǎn)物。

用酵母篩選[42]證明了擬南芥的CYP79B2和CYP79B3可催化Trp合成芥子油甙的前體物吲哚乙醛肟（IAOx），而IAOx是合成生長素的前體物質。研究人員將CY P79B2基因在擬南芥中異位表達，發(fā)現(xiàn)植物矮化、不育等生長素過剩的表型，從而確定CYP79B2參與了Trp合成生長素的反應（如圖2）[43]。同時發(fā)現(xiàn)在擬南芥中CYP79A1和CYP79A2可分別催化Tyr和Phe，并最終生成芥子油甙。

3.2 參與植物解毒代謝的P450基因

植物在自然條件下生長的過程中，常常受到病、蟲、菌等的侵害；以及一些除草劑、殺蟲劑和其他化學品的毒害。那么，存在于植物體內的P450就會作為參與除草劑第1階段解毒過程中的關鍵酶[44，15]，通過催化作用，在接收到非生物脅迫和外源有機化合物毒害時，進行毒性與非毒性化合物間的轉化，以此來抵抗各種外界壓力。1969年Frear等研究發(fā)現(xiàn)棉花幼苗微粒體中存在能夠代謝滅草隆（monuron）的混合功能氧化酶，這直接證明了植物細胞色素P450酶系參與除草劑代謝并具有解毒功能[46]。目前，細胞色素P450參與部分種類除草劑代謝已得到人們廣泛的認可，且細胞色素P450在植物體內過量表達，可提高對不同作用機理的除草劑的抗性[47]，隨著研究的深入，分離參與除草劑降解的相關基因成了人們研究的熱點。

1993年首次從向日葵中得到了具有除草劑抗性的植物P450基因CYP73A1，該基因對綠麥隆（chlorotoluron）有一定的催化代謝作用[48]。Robineau等[49]發(fā)現(xiàn)菊芋（Jerusalem artichoke）CYP76B1能代謝除草劑綠麥隆和利谷?。╨inuron），在煙草（Nicotiana tabacum）中表達的CYP76B1對綠麥隆和利谷隆的抗性分別增加了10倍和20倍。煙草CYP81B2、CYP71A11[50]和大豆（Gycine max）CYP71A10[51]也能代謝脲類除草劑。在酵母中表達的小麥CYP71C6v1基因，表現(xiàn)出了對氯磺?。╟hlorsulfuron）和醚苯磺隆（Triasulfuron）的5-羥基化酶活性，同樣也能催化甲磺?。╩etsulfuron-methyl）、芐嘧磺?。╞ensulfuron methyl）和苯磺隆（tribenuron-methly）代謝為未知化合物[52]。Pang等[53]從水稻中分離到的由Bel基因編碼的CYP81A6，研究證實這種新發(fā)現(xiàn)的細胞色素P450與水稻抗苯達松（bentazone）和磺酰脲類除草劑有關。2002年Didierjean等[54]以從向日葵中克隆出的CYP76B1和P450還原酶的融合蛋白進行轉基因實驗的結果顯示，單獨的CYP76B1對除草劑的代謝能力比融合蛋白轉基因高。這意味著融合蛋白表達中蛋白的穩(wěn)定性下降導致其活性降低。由于除草劑的廣泛使用，現(xiàn)已成為生態(tài)環(huán)境的主要污染源，因此，利用CYP450對除草劑等人工合成物質的代謝研究顯得尤為重要。總之，細胞色素CYP450作為與除草劑代謝密切相關的解毒酶，為除草劑的開發(fā)應用和培育抗除草劑用的轉基因作物打下良好的基礎。

4 展望

隨著現(xiàn)代生物技術日臻完善，越來越多的植物CYP450被分離，但它仍是該領域研究的重點和難點。其次，到目前為止，已成功分離的上萬個CYP450中，只有極少數(shù)的基因功能被鑒定。因此以分離植物CYP450基因為前提，驗證與測定它們的生物化學功能是目前植物P450研究的焦點。另外，CYP450基因的表達調節(jié)主要是轉錄水平的調節(jié)，以及一些生物和非生物因子的調節(jié)，如光的誘導、組織器官的特異性和發(fā)育分化等因素的影響，因此植物CYP450基因的表達和調控也是今后一段時間的研究熱點。對于植物P450基因的研究，無論在理論上探索植物各種合成代謝途徑、選擇進化，以及與環(huán)境的關系，還是在植物基因工程及作物改良中，包括參與創(chuàng)造雄性不育系、培養(yǎng)抗除草劑作物品種等方面都具有廣泛而深遠的意義，這為生物化學與分子生物學、環(huán)境科學、臨床醫(yī)學等領域的發(fā)展奠定了基礎。

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