楊華庚 顏速亮 陳慧娟 鄧志聲

摘 要 以苗齡約8個月的中粒種咖啡袋育苗為材料，測定3種干旱脅迫強度下咖啡幼苗葉片的生理指標變化，旨在了解其對干旱脅迫的生理響應。結果表明：在輕度干旱脅迫下（土壤相對含水量為55%～60%），與對照相比，中粒種咖啡幼苗葉片的可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性極顯著增加，而丙二醛（MDA）含量和相對電導率沒有顯著變化。但在中度干旱或重度干旱脅迫下（土壤相對含水量為40%～45%或25%～30%），可溶性蛋白含量、SOD、POD、CAT活性顯著或極顯著減少，而可溶性糖、脯氨酸的積累減緩，MDA含量和相對電導率迅速上升。在適度干旱脅迫下，中粒種咖啡幼苗可通過提高抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)能力來增強其對干旱脅迫的耐性。

關鍵詞 中粒種咖啡；干旱脅迫；抗氧化作用；滲透調(diào)節(jié)；膜脂過氧化；質(zhì)膜透性

中圖分類號 S571.2 文獻標識碼 A

水分虧缺是影響咖啡生產(chǎn)的主要環(huán)境脅迫因子[1]。干旱不僅影響咖啡的生長發(fā)育，還會造成咖啡的大幅度減產(chǎn)及品質(zhì)下降，給生產(chǎn)帶來重大損失。據(jù)報道，2010年4月下旬，由于嚴重干旱，有近1.60 萬hm2的咖啡樹受害，約占云南當年咖啡種植面積的60%，造成的經(jīng)濟損失近6億元[2]。冬春干旱和夏秋間歇干旱在中國咖啡種植區(qū)普遍發(fā)生，對中國咖啡生產(chǎn)造成不同程度的影響，是中國咖啡生產(chǎn)上不可忽視的重要問題。因此，研究咖啡的抗旱性對中國咖啡生產(chǎn)具有重要意義。水分虧缺影響咖啡植株的生理生態(tài)過程，已有研究結果表明，在干旱脅迫下，咖啡植株凈光合速率下降[3-4]，PSII有效光量子產(chǎn)額和電子傳遞活性減弱[5]，光抑制增強[3]，碳代謝酶活性發(fā)生變化，糖類物質(zhì)增加而淀粉含量減少[1-3]，蒸騰作用降低，葉水勢減少[4]，膜脂過氧化作用加劇[6]，抗氧化酶活性增強[5，7]。目前，相關研究較多集中于干旱脅迫對咖啡光合作用的影響，而缺乏對干旱脅迫下咖啡植株的抗氧化和滲透調(diào)節(jié)機制的系統(tǒng)深入研究。為此，本試驗采用人工控水的方法設置不同的土壤水分梯度，研究不同干旱脅迫強度對中粒種咖啡幼苗的抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、膜脂過氧化、質(zhì)膜透性的影響，旨在了解中粒種咖啡幼苗對干旱脅迫的生理響應，為中粒種咖啡栽培的水分管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

從中粒種咖啡無性系興隆24-2植株上采摘充分成熟的果實，去除果肉后取出咖啡豆，經(jīng)洗滌、適當晾干后，在砂床中播種催芽。當種子萌發(fā)至子葉平展后移入裝有等量培養(yǎng)土的育苗缽中，育苗缽的規(guī)格為口徑寬10 cm，高12 cm，培養(yǎng)土按腐熟牛糞 ∶ 壤土 ∶ 沙土=2 ∶ 7 ∶ 1進行配制，每缽定植咖啡苗1株。在育苗過程中，給予適當?shù)氖a蔽，做好正常的水肥管理。當幼苗經(jīng)8個月左右的生長，高約10 cm，有8片葉左右時，選取株齡、生長一致的咖啡幼苗120株，參照Hsiao[8]的方法劃分，對其進行4種水分處理：對照（土壤相對含水量為75%～80%）、輕度干旱脅迫（土壤相對含水量為55%～60%）、中度干旱脅迫（土壤相對含水量為40%～45%）、重度干旱脅迫（土壤相對含水量為25%～30%）。每處理重復5次，每重復6缽苗。干旱脅迫前，對各苗缽進行充分澆水，待缽內(nèi)水分自然消耗至設定土壤含水量標準范圍后，每天早上8： 00和傍晚18： 00用稱重補水法控制土壤含水量在設定范圍內(nèi)，維持2 d后結束脅迫處理。隨即采摘幼苗植株頂端往下第2片成熟葉測定相關生理指標。在試驗期間，苗木生長的室內(nèi)環(huán)境溫度處于24～30 ℃范圍內(nèi)，相對濕度處于60%～75%范圍內(nèi)。

1.2 生理指標測定

粗酶液提?。悍Q取葉樣0.5 g放入研缽內(nèi)，加入少量經(jīng)預冷的50 mmol/L pH7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含1%PVP），在冰浴上研磨，磨成勻漿后移入離心管內(nèi)，使提取液終體積為5 mL。將提取液放置于4 ℃ 11 000 ×g冷凍離心機內(nèi)離心20 min，上清液用于SOD、POD、CAT 活性、可溶性蛋白質(zhì)含量的測定。酶活性的測定：SOD活性采用氮藍四唑（NBT）法[9]測定，以抑制NBT光化還原的50%為1個酶活性單位；POD活性采用分光光度計法[10]測定，以每分鐘吸光度增加0.01的酶量為1個酶活單位（U）；CAT活性采用紫外吸收法[11]測定，以每分鐘吸光度減少0.01的酶量為1個酶活單位（U）。質(zhì)膜透性采用電導率儀法[12]測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸法[11]測定，脯氨酸含量采用茚三酮法[9]測定，可溶性糖含量采用蒽酮比色法[9]測定，可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍G-250染色法[9]測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行整理分析，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件中的Duncan法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對咖啡幼苗膜脂過氧化和質(zhì)膜透性的影響

MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，其含量高低反映了膜脂過氧化作用的強弱。相對電導率是衡量質(zhì)膜透性大小的指標，其數(shù)值的大小反映了質(zhì)膜受損的程度。由圖1和圖2可知，MDA含量和相對電導率隨干旱脅迫強度的增加呈上升的趨勢。輕度干旱脅迫時，MDA含量比對照的增加了7.03%，但兩者間差異不顯著。隨著干旱脅迫程度的進一步加深，MDA含量顯著增加。中度干旱脅迫和重度干旱脅迫時，MDA含量分別比對照的增加了17.48%和33.87%。輕度干旱脅迫時，相對電導率略有降低，只比對照的下降了1.11%，但兩者間差異不顯著。隨著干旱脅迫強度的進一步增加，相對電導率極顯著上升。中度干旱脅迫和重度干旱脅迫時，相對電導率分別比對照的增加了1.21、2.58倍。不斷加大的干旱脅迫強度，促進了咖啡幼苗膜脂過氧化和質(zhì)膜的損傷。

2.2 干旱脅迫對中粒種咖啡幼苗抗氧化酶活性的影響

SOD、POD和CAT是清除活性氧毒害的重要抗氧化酶。其中，SOD處于核心酶的地位，催化O2·- 發(fā)生歧化反應生成H2O2，而生成的H2O2則由POD和CAT清除。輕度干旱脅迫時，SOD、POD和CAT活性迅速增強，分別比對照的增加了37.52%、42.59%和1.41倍，差異達極顯著水平。隨著干旱脅迫強度的進一步增加，SOD、POD和CAT活性顯著或極顯著下降。重度干旱脅迫時，SOD、POD活性顯著或極顯著低于對照水平，分別比對照的下降了13.07%、56.36%，而CAT活性仍極顯著高于對照水平，比對照的增加了43.59%。SOD、POD和CAT活性的提高起到了保護咖啡幼苗免受活性氧毒害的作用。

2.3 干旱脅迫對中粒種咖啡幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸是植物細胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在逆境脅迫中發(fā)揮滲透調(diào)節(jié)作用。輕度干旱脅迫時，可溶性蛋白含量極顯著增加，比對照的增加了4.74%。隨著干旱脅迫強度的進一步增加，可溶性蛋白含量顯著或極顯著下降。重度干旱脅迫時，可溶性蛋白含量略比對照的下降了0.59%，但兩者間差異不顯著。輕度干旱脅迫時，脯氨酸含量極顯著增加，比對照的增加了35.40%。隨著干旱脅迫強度的不斷增加，脯氨酸積累趨緩，中度干旱或重度干旱脅迫時，脯氨酸含量分別比輕度干旱脅迫的增加了8.29%和9.94%，但3種脅迫處理間差異不顯著。干旱脅迫下，隨著脅迫強度的加深，可溶性糖分含量顯著增加；但在重度干旱脅迫時，可溶性糖含量增幅趨緩，此時可溶性糖含量僅比中度干旱脅迫的增加了7.54%，且兩者間差異不顯著。綜上所述，干旱脅迫下，可溶性蛋白、脯氨酸和可溶糖的積累，提高了咖啡幼苗的滲透調(diào)節(jié)能力。

3 討論與結論

干旱脅迫對植物的危害首先表現(xiàn)在對質(zhì)膜系統(tǒng)的傷害，而膜脂過氧化和質(zhì)膜相對透性則反映了質(zhì)膜受損傷的過程。本實驗結果表明，干旱脅迫下，膜脂過氧化加劇，質(zhì)膜透性明顯增大，是導致中粒種咖啡幼苗嚴重受害的重要原因之一。這與在小粒種咖啡的研究結果[6]一致。

干旱脅迫下，自由基的產(chǎn)生與清除機制失衡，O2·- 和H2O2等活性氧大量積累[13-15]。此時，維持較高的SOD、POD、CAT活性，有利于抑制O2·- 和H2O2的積累，防止膜系統(tǒng)遭受嚴重破壞，從而有利于增強植株的耐旱性[14]。本實驗結果表明，在輕度干旱脅迫下，中粒種咖啡幼苗的SOD、POD、CAT活性極顯著增強，三者協(xié)同作用，極大地提高了清除活性氧的能力，從而減緩了膜脂過氧化，使質(zhì)膜系統(tǒng)損傷輕微，表現(xiàn)為MDA含量和相對電導率并沒有顯著的變化。Pinheiro等[7]也報道了干旱脅迫下中粒種咖啡的SOD、POD、CAT活性增強的結果。隨著干旱脅迫強度超出咖啡幼苗自身的抵御能力時，活性氧的代謝平衡遭到破壞，過量積累的活性氧對酶結構造成損傷，使SOD、POD、CAT活性顯著或極顯著降低。由于不能有效地清除過量的活性氧，從而導致細胞結構及核酸、脂類和蛋白質(zhì)分子的氧化破壞，引發(fā)或加劇膜脂過氧化作用，使質(zhì)膜的流動性降低，滲漏量增加，膜蛋白、失活受體、酶和離子通道遭受損傷，破壞了質(zhì)膜的結構和功能，影響了細胞內(nèi)各種生理代謝的正常進行，甚至導致細胞死亡[16]，咖啡植株受害日趨嚴重，甚至死亡。董建華等[6]研究表明，隨著干旱脅迫天數(shù)的增加，小粒種咖啡幼苗的POD活性不斷上升。這與本研究結果不同，可能與試驗材料和方法有關。

可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能增加細胞內(nèi)的溶質(zhì)濃度，降低植物體內(nèi)的滲透勢和水勢，防止細胞脫水，有利于細胞保水和維持一定的膨壓，以保證正常生理代謝活動的進行[17]。此外，可溶性糖和脯氨酸還起到了清除活性氧（ROS），保持膜結構完整性的作用[18]。本實驗中，輕度干旱脅迫時，可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量極顯著增加，有助于降低咖啡幼苗細胞的滲透勢，增強細胞的防脫水和保水能力，從而維持了細胞結構的完整性，這是中粒種咖啡幼苗主動防御干旱脅迫的適應性反應。隨著干旱脅迫強度的進一步增加，咖啡幼苗的可溶性蛋白含量顯著下降，而可溶性糖和脯氨酸的積累趨緩。這表明在嚴重干旱脅迫下，咖啡幼苗的可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸的積累機制受到了嚴重破壞，從而減弱了滲透調(diào)節(jié)對咖啡幼苗的保護作用，使咖啡幼苗受害趨于嚴重。輕度干旱脅迫可能誘導了咖啡幼苗的脅迫應答基因的表達[19-20]，合成了包括抗旱防御蛋白在內(nèi)的差異蛋白[21-24]，從而增加了可溶性蛋白含量。然而在重度干旱脅迫下，由于蛋白水解酶活性提高，加快了蛋白質(zhì)的水解[25]，并抑制了蛋白質(zhì)的合成活性，使蛋白質(zhì)合成量減少，導致可溶性蛋白含量顯著下降。干旱脅迫可能通過增強谷氨酰胺合成酶活性[23]，減弱脯氨酸氧化酶活性[26]來促進咖啡幼苗葉片脯氨酸的積累；也可能通過增強淀粉磷酸化酶和蔗糖磷酸合成酶活性，降低轉化酶活性[27]來增加咖啡幼苗葉片可溶性糖的積累。董建華等[6]研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下，小粒種咖啡幼苗可溶性蛋白含量不斷下降，而脯氨酸含量持續(xù)上升。Praxedes等[1]研究表明，在干旱脅迫下，耐旱性強的中粒種咖啡無性系的可溶性糖含量顯著增加，而其余無性系的可溶性糖含量均無顯著變化。上述結果表明，可溶性糖和脯氨酸是咖啡植株抵御干旱脅迫的2種重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可在一定程度上緩解干旱脅迫對咖啡植株所造成的傷害。

綜上所述，在輕度干旱脅迫下，中粒種咖啡幼苗通過增強抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)能力來主動防御干旱危害，以維持其正常的生長發(fā)育。隨著干旱脅迫強度的增加，咖啡幼苗的防御機制受到削弱，甚至受到嚴重破壞，植株受害日趨嚴重?？梢?，中粒種咖啡幼苗對干旱脅迫較敏感。在生產(chǎn)上，可通過維持輕度干旱脅迫來提高咖啡植株的抗旱能力，以增強在干旱條件下的生長適應性。

參考文獻

[1] Praxedes S C， DaMatta F M， Loureiro M E， et al. Effects of long-term soil drought on photosynthesis and carbohydrate metabolism in mature robusta coffee（Coffea canephora Pierre var. kouillou）leaves[J]. Environmental and Experimental Botany，2006， 56（3）： 263-273.

[2] 伍 平. 云南咖啡產(chǎn)業(yè)因旱損失6億[N]. 云南科技報， 2010-4-30（5）.

[3] DaMatta F M， Maestri M， Barros B S. Photosynthetic performance of two coffee species under drought[J]. Photosynthetica， 1998， 34（2）： 257-264.

[4] DaMatta F M， Chaves A R M， Pinheiro H A， et al. Drought tolerance of two field-grown clones of Coffea canephora[J]. Plant Science， 2003， 164（1）： 111-117.

[5] Lima A L S， DaMatta F M， Pinheiro H A， et al. Photochemical responses and oxidative stress in two clones of Coffea canephora under water deficit conditions[J]. Environmental and Experimental Botany， 2002， 47（3）： 239-247.

[6] 董建華，王秉忠. 土壤干旱對小粒種咖啡有關生理參數(shù)的影響[J]. 熱帶作物學報， 1996， 17（1）： 50-56.

[7] Pinheiro H A， DaMatta F M， Chaves A R M， et al. Drought tolerance in relation to protection against oxidative stress in clones of Coffea canephora subjected to long-term drought[J]. Plant Science， 2004， 167（6）： 1 307-1 314.

[8] Hsiao T C. Plant responses to water stress[J]. Annual Review of Plant Physiology， 1973， 24（3）： 519-570.

[9] 李合生， 孫 群， 趙世杰，等. 植物生理生化實驗原理和技術[M]. 北京：高等教育出版社， 2000： 167-169， 184-185， 195-197， 258-260.

[10] 鄭炳松， 嚴逸倫， 吳家森， 等. 現(xiàn)代植物生理生化研究技術[M]. 北京： 氣象出版社， 2006： 41-42.

[11] 孔祥生， 易現(xiàn)峰. 植物生理學實驗技術[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2008： 70-72， 129-131， 257-259.

[12] 郝建軍， 康宗利， 于 洋， 等. 植物生理學實驗技術[M]. 北京： 化學工業(yè)出版社， 2007： 169-173.

[13] 陳文榮， 曾瑋瑋， 李云霞，等. 高叢藍莓對干旱脅迫的生理響應及其抗旱性綜合評價[J]. 園藝學報， 2012， 39（4）： 637-646.

[14] 劉 艷， 蔡貴芳，陳貴林. 干旱脅迫對甘草幼苗活性氧代謝的影響[J]. 中國草地學報， 2012， 34（5）： 93-98.

[15] Bian S M， Jiang Y W. Reactive oxygen species，antioxidant enzyme activities and gene expression patterns in leaves and roots of Kentucky bluegrass in response to drought stress and recovery[J]. Scientia Horticulturae， 2009， 120（2）： 264-270.

[16] Gill S S， Tuteja N. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2010， 48（12）： 909-930.

[17] 張明生， 彭忠華， 謝 波，等. 甘薯離體葉片失水速率及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與品種抗旱性的關系[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2004， 37（1）： 152-156.

[18] Moustakas M， Sperdouli I， Kouna T， et al. Exogenous proline induces soluble sugar accumulation and alleviates drought stress effects on photosystem Ⅱfunctioning of Arabidopsis thaliana leaves[J]. Plant Growth Regulation， 2011， 65（2）： 315-325.

[19] Prabu G， Kawar P G， Pagariya M C， et al. Identification of water deficit stress upregulated genes in sugarcane[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2011， 29（2）： 291-304.

[20] Govind G，ThammeGowda H V， Kalaiarasi P J， et al. Identification and functional validation of a unique set of drought induced genes preferentially expressed in response to gradual water stress in peanut[J]. Molecular Genetics and Genomics， 2009， 281（6）： 591-605.

[21] Deeba F， Pandey A K， Ranjan S， et al. Physiological and proteomic responses of cotton（Gossypium herbaceum L.）to drought stress[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2012， 53： 6-18. [22] Xu C P， Huang B R. Differential proteomic responses to water stress induced by PEG in two creeping bentgrass cultivars differing in stress tolerance[J]. Journal of Plant Physiology，2010， 167（17）： 1 477-1 485.

[23] 祁建民， 姜海青， 陳美霞，等. 干旱脅迫下紅麻葉片的差異蛋白表達分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2012， 45（17）： 3 632-3 638.

[24] 葉景秀. 青海高原春小麥PEG脅迫與復水后葉片差異蛋白質(zhì)組學研究[J]. 中國生物化學與分子生物學報， 2012， 28（11）： 1 049-1 056.

[25] 任東濤，趙松嶺. 水分脅迫對半干旱區(qū)春小麥旗葉蛋白質(zhì)代謝的影響[J]. 作物學報， 1997， 23（4）： 468-473.

[26] Abdul Jaleel C， Manivannan P， Sankar B， et al. Calcium chloride effects on salinity-induced oxidative stress，proline metabolism and indole alkaloid accumulation in Catharanthus roseus[J]. Comptes Rendus Biologies， 2007， 330（9）： 674-683.

[27] Dubey R S，Singh A K. Salinity induces accumulation of soluble sugars and alters the activity of sugar metabolizing enzymes in rice plants[J]. Biologia Plantarum， 1999， 42（2）：233-239.

責任編輯：黃東杰