胡睿琦 王建敏 王楠 于洋

摘要 [目的]合理利用動物血液，優(yōu)化冰醋酸提取豬血紅素的方法。[方法]試驗以新鮮豬血為原料，采用冰醋酸法提取新鮮豬血中的血紅素，考察冰醋酸的添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、氯化鈉添加量等因素對血紅素提取的影響。[結(jié)果]試驗表明，冰醋酸法提取豬血紅素的最佳工藝為：冰醋酸添加量為血球4倍，氯化鈉添加量為血球的2.4%，反應(yīng)時間30 min，反應(yīng)溫度為95 ℃，此條件下提取的血紅素含量為40.2%。[結(jié)論]研究可為豬血資源的合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 血紅素；冰醋酸法；提取

中圖分類號 S879.9 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）16-05211-03

動物血液總量一般為體重的5%～8%，其中含有20%的干物質(zhì)，而蛋白質(zhì)含量高達90%，是一巨大的蛋白資源。然而，我國許多屠宰場將牲畜屠宰后的血液主要用于制作菜肴、血粉、血罐頭和血醬油等低附加值的產(chǎn)品，還有相當一部分的血液直接排入環(huán)境，這樣既浪費了寶貴的蛋白質(zhì)資源，又嚴重污染了環(huán)境。合理利用動物血液，可提高經(jīng)濟效益，減少環(huán)境污染，同時有益于人類身體健康[1-3]。從血液中提取的血紅素是一種安全、穩(wěn)定的天然色素，同時也是人類良好的補鐵劑，現(xiàn)已逐漸用于食品行業(yè)的著色劑[4]。

當今工業(yè)上采用冰醋酸法提取血紅素[5]，此法是俄國學者Schalteieff最早用于實驗室提取、分離血紅素的一種方法[6]，它是利用冰醋酸、氯化鈉和血共熱得到血紅素結(jié)晶。利用冰醋酸從豬血球中提取血紅素的方法中，國內(nèi)外很少見到有關(guān)冰醋酸的添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、氯化鈉添加量等因素對血紅素提取影響的報道。因此，筆者針對這些因素對提取血紅素的影響進行探討，為完善冰醋酸提取血紅素的方法，開發(fā)豬血資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 新鮮豬血，錦州市肉聯(lián)廠。主要試劑：檸檬酸鈉（AR），天津市津北精細化工有限公司；氯化鈉（AR），天津市鳳船化學試劑科技有限公司；冰醋酸（AR），天津市鳳船化學試劑科技有限公司；氫氧化鈉（AR），沈陽市新化試劑廠；血紅素標準品（BR），上海金穗生物科技有限公司。主要儀器：飛鴿牌TDL.5.A型離心機，上海安亭科學儀器廠；旋片式真空泵，上海挺威真空設(shè)備有限公司；752型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；101.3A101.3A型烘干箱，上海善志儀器設(shè)備有限公司；PHS.25型實驗室pH計；BCD.160TXB型冰箱，北京博通躍科貿(mào)有限公司。

1.2 方法[7-9]

1.2.1 原料處理。向1 kg新鮮豬血中加入15%的檸檬酸三鈉，添加量為血量的4%，充分混勻。取抗凝后的豬血，用離心機在3 600 r/min的條件下離心15 min，去除上層血清液，用濃度9%的生理鹽水清洗后，在相同條件下離心，過100目篩，除上清液，將下層血球置于容器中，并于0～4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血紅素提取。向錐形瓶中分別加入一定量的冰醋酸與溶解的氯化鈉溶液，小心加入10 g豬血球，再連接冷凝管，分別在一定溫度下反應(yīng)一段時間后，停止加熱，冷卻至室溫，放置過夜。用真空泵連接布氏漏斗進行抽濾。抽濾后，置于110 ℃烘干箱內(nèi)干燥至恒重，并研成細粉，得血紅素粗品。工藝流程如下：原料→抗凝血處理→離心→血球→提取→提取液→沉淀→抽濾→粗血紅素→抽濾→濾渣→烘干→研磨→血紅素粗品。

1.2.3 血紅素樣品含量測定。稱取20.0 mg研磨成細粉的血紅素粗品，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液溶解，并定容到100 ml容量瓶，搖勻，過濾。再取10 ml濾液于100 ml容量瓶中，以0.1 mol/L氫氧化鈉定容。以0.1 mol/L氫氧化鈉作為試劑空白，在波長403 nm處測定血紅素樣品的吸光度（OD），代入回歸方程即可求出血紅素樣品的含量。

1.2.4 單因子試驗。 在利用冰醋酸提取血紅素的方法中，主要影響血紅素最佳提取條件的因素有反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、冰醋酸的添加量、氯化鈉的添加量等。試驗以10 g豬血球反應(yīng)物，以血紅素含量為指標，反應(yīng)溫度為80、85、90、95、100 ℃；反應(yīng)時間為10 、20 、30 、40 、50 min；冰醋酸添加量為豬血球的2、3、4、5、6倍；氯化鈉的添加量分別為血球的0.8%、1.6%、2.4%、3.2%、4.0%。每一組試驗做3次平行。

1.2.5 正交試驗。在單因子試驗的基礎(chǔ)上，選擇L9（34）正交試驗表對反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、冰醋酸添加量以及氯化鈉添加量這4個因素進行優(yōu)化，設(shè)置3水平因子，反應(yīng)溫度為85、90、95 ℃；反應(yīng)時間為20、30、40 min；冰醋酸添加量為豬血球的3、4、5倍；氯化鈉添加量為血球的1.6%、2.4%、3.2%。每一組做3次平行試驗，正交試驗因素水平設(shè)計如表1所示。

1.2.6 標準血紅素供試液的制備。精密稱取20.0 mg標準血紅素對照品，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶解，并定容到100 ml的容量瓶中，搖勻備用。

1.2.7 標準曲線制備。分別精確稱取標準血紅素供試液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，用0.1 mol/L氫氧化鈉定容到100 ml的容量瓶中，搖勻，以0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液作為空白對照，在403 nm波長處測定其吸光度（OD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線 試驗得到不同濃度標準血紅素供試液吸光度，見表2，并制作血紅素標準曲線，如圖1所示。

可見分光光度法測得血紅素標準曲線為y=0.077 9x+0.005 4，R2=0.999 6。由圖1可知，濃度在2.00～10.00 μg/ml范圍內(nèi)吸光度（OD）與濃度C呈線性相關(guān)。

2.2 反應(yīng)溫度對血紅素提取量的影響 根據(jù)資料與預(yù)試驗，選定反應(yīng)時間為30 min，冰醋酸添加量為血球的4倍，氯化鈉添加量為血球的1.5%，反應(yīng)溫度分別為80、85、90、95、100 ℃，考察反應(yīng)溫度對血紅素提取的影響。由圖2可見，當反應(yīng)溫度為95 ℃時，血紅素提取量最高，超過95 ℃，提取量下降。因此，反應(yīng)溫度為95 ℃提取血紅素較佳。

圖2 反應(yīng)溫度對血紅素提取量的影響2.3 反應(yīng)時間對血紅素提取量的影響 根據(jù)資料，選定反應(yīng)溫度是95 ℃，冰醋酸添加量為血球的4倍，氯化鈉添加量為血球的1.5%，反應(yīng)時間分別為10、20、30、40、50 min，考察反應(yīng)時間對血紅素提取量的影響。由圖3可見，當反應(yīng)時間為30 min時，血紅素提取量最高。因此，取反應(yīng)時間為30 min提取血紅素效果較好。

圖3 反應(yīng)時間對血紅素提取量的影響2.4 冰醋酸添加量對血紅素提取量的影響 根據(jù)資料，選定反應(yīng)溫度是95 ℃，反應(yīng)時間為30 min，氯化鈉添加量為血球的1.5%，冰醋酸添加量分別為血球的2、3、4、5、6 倍，考察冰醋酸添加量對血紅素提取的影響。由圖4可見，當冰醋酸添加量為血球的4倍時，血紅素的提取量最高。因此，取冰醋酸添加量為血球的4倍提取血紅素效果較好。

圖4 冰醋酸添加量對血紅素提取量的影響2.5 氯化鈉添加量對血紅素提取量的影響 根據(jù)試驗，選定因溫度是95 ℃，反應(yīng)時間為30 min，冰醋酸添加量為血球的4倍，氯化鈉添加量分別為血球的0.8%、1.6%、2.4%、3.2%、4.0%，考察氯化鈉添加量對血紅素提取的影響。由圖5可見，氯化鈉添加量為血球的2.4%時，血紅素的提取量最高。因此，取氯化鈉添加量為血球的2.4%提取血紅素效果較好。

圖5 氯化鈉添加量對血紅素提取量的影響2.6 正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇L9（34）正交試驗表對反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、冰醋酸添加量以及氯化鈉添加量這4個因素優(yōu)化，進行正交試驗，結(jié)果如表3所示。

由表3可看出，4個因素對血紅素的提取量都會產(chǎn)生不同程度影響，對其反應(yīng)的影響大小依次為：冰醋酸添加量>反應(yīng)溫度>反應(yīng)時間>氯化鈉添加量，因此得出最優(yōu)組合為A3B2C2D2，即反應(yīng)溫度95 ℃，反應(yīng)時間30 min，冰醋酸添加量為血球的4倍，氯化鈉添加量為血球的2.4%為最佳條件。

方差分析得出，F(xiàn)A=3 260，F(xiàn)B=1 865，F(xiàn)C=3 575，F(xiàn)D=560，4個因素的F值都大于F0.01（2，8）=8.65，則4因素對血紅素的提取量的影響極顯著。

3 討論

雖然有學者對冰醋酸提取血紅素進行了研究，但他們采取的工藝參數(shù)存在較大的差異，且有關(guān)冰醋酸的添加量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度以及氯化鈉添加量對血紅素提取的影響報道較少。該試驗采用冰醋酸法提取血紅素得出反應(yīng)溫度95 ℃，反應(yīng)時間30 min，冰醋酸添加量為血球的4倍，氯化鈉添加量為血球的2.4%為最佳條件。

趙緒妙報道，向豬血中加入4倍血量的冰醋酸，在90 ℃條件下保溫30 min來提取血紅素[10]。而羅先雋提出，向豬血中加入4倍血量的冰醋酸，但提取血紅素的溫度為l00～105 ℃[11]。鐘耀廣提出，冰醋酸與血球比例為4.4∶1、溫度為105 ℃、時間為40 min、氯化鈉添加量為血球的1.5%為最佳工藝參數(shù)[12]。該試驗所取的原料為全血，故消耗的冰醋酸較多。

利用冰醋酸提取豬血球中血紅素的方法要求血液新鮮、衛(wèi)生，血紅素對光敏感，易氧化破壞，整個試驗過程要避免強光照射，成品應(yīng)保存于棕色瓶中。

新鮮豬血中含有大量凝血因子和凝血酶原，在鈣離子存在時，凝血因子和凝血酶原被激活而發(fā)生作用，使血凝結(jié)成團，血液由流體變成凝膠，影響了血細胞的分離。因此，新鮮豬血必須采取抗凝措施。由于檸檬酸能使鈣離子沉淀，并且檸檬酸與鈣離子作用所得的生成物可直接進入代謝，對人體無副作用，故可選檸檬酸及其鈉鹽作為抗凝劑。

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