易克賢 鄭金龍 習(xí)金根等

摘 要 利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對181個(gè)中國柱花草膠孢炭疽菌菌株進(jìn)行了基因組DNA分析。分析結(jié)果表明柱花草膠孢炭疽菌株DNA存在顯著的多態(tài)性。聚類分析結(jié)果表明181個(gè)中國柱花草膠孢炭疽菌株可劃分成4大組，但大多數(shù)聚于第Ⅰ和Ⅱ組，而第Ⅰ、Ⅱ組下又分別分為4個(gè)亞組，表明中國柱花草膠孢炭疽菌正在出現(xiàn)種內(nèi)遺傳分化。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明中國菌株存在著廣泛的生物多樣性和遺傳變異性，海南菌株與廣東、廣西的菌株相比多樣性較豐富，致病力更強(qiáng)；而海南菌株又以東方、昌江、中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院儋州所部（簡稱“兩院”）3個(gè)地區(qū)的菌株多樣性最為豐富，毒性譜最廣泛，這可能與海南種植柱花草歷史相對較長、引種活動(dòng)和生產(chǎn)活動(dòng)更為頻繁等有關(guān)。

關(guān)鍵詞 柱花草；炭疽病；遺傳多態(tài)性；AFLP；分子標(biāo)記

中圖分類號(hào) S541+.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

柱花草（Stylosanthes spp.）又名筆花豆（penciflower），天然分布在中南美洲、熱帶北美洲、非洲及東南亞[1]。是全球熱帶地區(qū)栽培面積最大應(yīng)用最廣泛的優(yōu)良豆科牧草，它具有產(chǎn)量高、耐旱、耐酸、耐貧瘠等優(yōu)良特性，適于在熱帶、南亞熱帶地區(qū)種植，具有很大的發(fā)展?jié)摿2]。

影響柱花草生產(chǎn)的主要病害是柱花草炭疽?。⊿tylo anthracnose）。柱花草炭疽病主要由半知菌類炭疽菌屬的膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起，有時(shí)亦可由該屬的平頭炭疽菌（C.truncatum）和菜豆炭疽菌（C. lindemuthianum）引起[3]。我國1962年從馬來西亞引入柱花草[4]。自推廣種植以來，由于受到柱花草炭疽病的危害，其產(chǎn)量受到嚴(yán)重影響[3]。柱花草炭疽病病原菌存在高度的生物多樣性和遺傳變異性[5]。各國的生產(chǎn)實(shí)踐均證明一個(gè)抗病的柱花草品種使用10年后就會(huì)變成感病品種。而同一品種的柱花草在不同地點(diǎn)的感染程度有差異。炭疽菌分離菌的地理分布與柱花草宿主的自然分布相關(guān)。

AFLP技術(shù)因具有靈敏度高、快速、多態(tài)性強(qiáng)、DNA的用量少、重復(fù)性高等諸多優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于真菌分類鑒定和遺傳多樣性的研究[6-7]。因此該技術(shù)可以檢測到傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法無法區(qū)分的相似菌株種間和種內(nèi)差別，它能快速偵測到新的侵染力強(qiáng)的菌株的出現(xiàn)及其種群的消長和遷移動(dòng)態(tài)，便于及時(shí)采取相應(yīng)的措施。

本文是在對我國柱花草炭疽病害調(diào)查和病原收集的基礎(chǔ)上，進(jìn)行病原菌基因組DNA的AFLP多態(tài)性分析，以進(jìn)一步確定我國柱花草炭疽菌的遺傳多態(tài)性和病原遺傳分化類型，為我國柱花草炭疽病抗病育種、病害預(yù)測及防治等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1997年至2004年本研究團(tuán)隊(duì)對我國柱花草炭疽病進(jìn)行了系統(tǒng)調(diào)查并分離獲得病原菌703份，從中選取有代表性的181個(gè)菌株進(jìn)行AFLP分析，菌株明細(xì)見表1。

1.2 方法

2 結(jié)果與分析

用8對引物對181個(gè)中國柱花草膠孢炭疽菌株進(jìn)行分析，每對引物都產(chǎn)生了清晰的AFLP指紋，形成的AFLP圖譜效果如圖1、2、3、4。應(yīng)用UPGMA法進(jìn)行聚類，獲得的聚類樹狀圖如圖5、6、7、8。結(jié)果表明，中國柱花草膠孢炭疽菌具有豐富的多樣性。181個(gè)炭疽菌株之間的相似系數(shù)在0.24～0.57之間，同時(shí)在相似系數(shù)約0.24處聚成4大組。第Ⅰ組共73個(gè)菌株，又在相似系數(shù)約0.25處分化成4個(gè)亞組；第Ⅱ組共60個(gè)菌株，又在相似系數(shù)約0.30處分化成4個(gè)亞組；第Ⅲ、Ⅳ組分別僅有12、20個(gè)菌株。以上結(jié)果表明中國柱花草炭疽菌正在出現(xiàn)種內(nèi)遺傳分化。

結(jié)合聚類圖5、6、7、8和表2可以看出，Ⅰ-1亞組、Ⅱ-1亞組、Ⅲ組菌株主要來自海南；Ⅰ-2亞組的菌株主要來自廣東；Ⅱ-2亞組、Ⅱ-3亞組菌株主要來自廣西；而Ⅰ-3、Ⅰ-4、Ⅱ-4、Ⅳ組菌株主要來自廣東和海南，結(jié)果表明菌株間出現(xiàn)不同程度的地域分布規(guī)律。

從表3、4、5還可看出，第Ⅰ組菌株侵染圭亞那、有鉤、粗糙、西布拉等所有的10個(gè)柱花草寄主品種，而第Ⅱ、Ⅳ組只侵染其中的5個(gè)寄主品種，第Ⅲ組僅侵染其中的4個(gè)寄主品種，說明第Ⅰ組菌株的毒力較強(qiáng)，毒性譜非常廣泛，而第Ⅱ、Ⅳ、Ⅳ組菌株的毒性譜較窄。從各省區(qū)的菌株組型分布情況看，海南東方、昌江、兩院的菌株多樣性豐富，覆蓋了所有的4個(gè)組型，而廣西和廣東菌株則相對簡單。這可能與海南種植柱花草歷史較長、大量從國外引種有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

3.1 柱花草膠孢炭疽菌株DNA存在顯著的多態(tài)性

本文采用8對不同的引物對181個(gè)來自海南、廣東和廣西的柱花草膠孢炭疽菌株進(jìn)行了較為全面和系統(tǒng)的AFLP分析，結(jié)果表明供試柱花草膠孢炭疽菌株DNA存在顯著的多態(tài)性。

181個(gè)炭疽菌株之間的相似系數(shù)為0.24～0.57，同時(shí)在相似系數(shù)約0.24處聚成4大組，但大多數(shù)菌株聚于第Ⅰ和Ⅱ組。而第Ⅰ組又在相似系數(shù)約0.25處分化成4個(gè)亞組；第Ⅱ組又在相似系數(shù)約0.30處分化成4個(gè)亞組；表明中國柱花草膠孢炭疽菌正在出現(xiàn)種內(nèi)遺傳分化，這與易克賢等人的研究相一致[10]。

3.2 柱花草膠孢炭疽菌株遺傳多態(tài)性具有地域性差異

本文的研究結(jié)果表明海南、廣東和廣西3省區(qū)柱花草膠孢炭疽菌株DNA遺傳多態(tài)性豐富程度海南菌株大于兩廣的菌株，而且同一省區(qū)內(nèi)不同地方的菌株其遺傳多態(tài)性亦表現(xiàn)出地域性差異。其中海南菌株又以東方、昌江、儋州兩院三地的菌株多樣性最為豐富，毒性譜最廣泛，這可能與各地柱花草的引種活動(dòng)、推廣種植的時(shí)間、規(guī)模程度和生態(tài)條件差異有關(guān)，引種和種植時(shí)間越長，病原菌為適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境，遺傳變異和進(jìn)化必然更加活躍[11]。

3.3 柱花草膠孢炭疽菌株表現(xiàn)出一定程度的?；纳?/p>

本研究結(jié)果表明，第Ⅰ組菌株侵染圭亞那、有鉤、粗糙、西布拉等所有的10個(gè)柱花草寄主品種，而第Ⅱ、第Ⅳ組只侵染其中的5個(gè)寄主品種，第Ⅲ組僅侵染其中的4個(gè)寄主品種，說明第Ⅰ組菌株的毒力較強(qiáng)，毒性譜非常廣泛，而第Ⅱ、Ⅳ、Ⅳ組菌株的毒性譜較窄。

3.4 AFLP可用于柱花草膠孢炭疽菌株種群遺傳變異的監(jiān)測和抗病育種

國外許多報(bào)道[12-14]均表明在柱花草的起源中心-南美和長期種植區(qū)其炭疽病菌存在著廣泛的生物多樣性和遺傳變異性，而在新種植區(qū)則相對簡單。本文研究表明，與國外研究結(jié)果相比，中國柱花草炭疽病菌遺傳多樣性要簡單得多，因此今后從其它國家進(jìn)行柱花草引種和推廣過程中，應(yīng)特別注意病原菌的檢疫和病害監(jiān)測，以防止新的侵染力強(qiáng)的病原菌株或小種從國外或老種植區(qū)帶入新區(qū)，影響中國柱花草的生產(chǎn)。此外本文研究結(jié)果表明中國柱花草炭疽病菌正出現(xiàn)一些新的種內(nèi)遺傳分化，因此有必要不斷加強(qiáng)綜合抗病品種的選育。

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