劉雨 廖明安 邱麗娜等

摘 要 利用相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）標(biāo)記對巴山脆李及達(dá)州地區(qū)優(yōu)良脆李資源進(jìn)行親緣關(guān)系分析，為巴山脆李品種的鑒定和其他李資源的保護(hù)及利用提供理論依據(jù)。從180對引物組合中篩選出12對多態(tài)性高、擴(kuò)增譜帶清晰的SRAP引物，對22份李資源進(jìn)行擴(kuò)增，共獲得103條譜帶，其中多態(tài)性譜帶64條，多態(tài)性比率為60.34%。平均每對引物組合擴(kuò)增出多態(tài)性譜帶5.42條。利用UPGMA法構(gòu)建樹狀聚類圖，在相似性系數(shù)0.68處可將22份樣品分成3組。聚類結(jié)果與按果形分類結(jié)果一致，與其地理位置和熟期也存在一定的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞 李；親緣關(guān)系；SRAP分析

中圖分類號 S662.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

李是薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）植物。為開發(fā)、保護(hù)和利用李資源，1992年達(dá)州地區(qū)對李樹進(jìn)行調(diào)查，通過果實(shí)品質(zhì)的評價(jià)初步篩選出65個(gè)比較優(yōu)良的變異單系，再對65個(gè)變異單系的物候期、生長結(jié)果習(xí)性等進(jìn)行調(diào)查測試，進(jìn)一步篩選出22個(gè)優(yōu)異變異單系。從22個(gè)變異單系中審定了‘巴山脆李品種?！蜕酱嗬頪1]是達(dá)州地區(qū)‘青脆李變異單系，來源于1株60余年的青脆李樹，在果形、平均單果質(zhì)量、成熟期上發(fā)生變異。為進(jìn)一步選育新品種，了解當(dāng)?shù)刭Y源的遺傳基礎(chǔ)與差異，需對親緣關(guān)系進(jìn)行分析研究。

國內(nèi)外學(xué)者曾從農(nóng)藝性狀[2]、孢粉學(xué)[3]、RAPD分子標(biāo)記[4]、SSR分子標(biāo)記[5]、ISSR分子標(biāo)記[6]等不同側(cè)面對李遺傳變異進(jìn)行分析，研究中國李種質(zhì)資源親緣關(guān)系，但存在一定的分歧。Li和Quiros[7]根據(jù)基因中外顯子富含CG，而內(nèi)含子和啟動(dòng)子富含AT的特點(diǎn)開發(fā)出獨(dú)特的雙引物設(shè)計(jì)對基因的ORFs（Open reading frames）的特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的SRAP分子標(biāo)記。目前SRAP分子標(biāo)記在屬內(nèi)種間[8]，種內(nèi)品種間[9]親緣關(guān)系鑒定中運(yùn)用廣泛，并且在親緣關(guān)系很近的種內(nèi)鑒定中表現(xiàn)優(yōu)良[10]，但SRAP在中國李中的應(yīng)用未見報(bào)道。筆者利用SRAP分子標(biāo)記對22份李資源進(jìn)行分析，旨在為巴山脆李品種的分子鑒定和其它李資源的保護(hù)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

參照謝志亮等[13]的方法從新鮮幼嫩葉片中提取李基因組DNA。DNA用Bio-Photometer核酸檢測儀檢測濃度，將純化的DNA稀釋到100 ng/μL備用。

反應(yīng)體系以Li與Qurio[7]提出的體系以及前人[12]在桃中建立優(yōu)化SRAP-PCR體系為參照，在25 μL體系中，Taq DNA聚合酶0.4 U，Mg2+ 1.5 mmol/L，模板DNA 45 ng，dNTPs 200 μmol/L，引物0.75 μmol/L。擴(kuò)增程序是94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃復(fù)性 1 min，72 ℃延伸90 s，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，50 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4 ℃保持?jǐn)U增結(jié)束后，取6 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液1×TBE（0.09 mmol/L Tris，0.002 mmol/L乙酸，1 mmol/L EDTA，pH8.0），電壓90 V電泳2 h，以100 bp DNA Ladder作為分子量標(biāo)記，EB染色后在SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照記錄。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Gel-Pro analyzer軟件獲取原始數(shù)據(jù)，電泳圖譜上有條帶記為“1”，同一位置沒有出現(xiàn)的帶記為“0”，從而生成由“1”和“0”組成的原始矩陣。計(jì)算多態(tài)性信息含量（Polymorphism information content）PIC=1-ΣPi2[14]。用NTSYS-pc 2.10（numerical taxonomy and multivariate analysissystem，NTSYS）[15]軟件進(jìn)行SM相似系數(shù)計(jì)算和基于UPGMA算法的聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性及親緣關(guān)系分析

2.2 基于SRAP標(biāo)記的聚類分析

從在相似系數(shù)SM=0.72處可將材料分為8組。巴山脆李、通川6號、通川7號各單獨(dú)分為一組，從分子水平上證實(shí)了巴山脆李品種與其他資源材料間存在遺傳差異。來自通川的資源除通川4號與通川8號全部分為一組，萬源的資源除萬源4號全部分為一組，表現(xiàn)出與果實(shí)成熟期相似的趨勢。其中巴山脆李和達(dá)縣1號相似系數(shù)為0.477 2，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。從選配親本的角度考慮，這兩種資源遺傳基礎(chǔ)較寬，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，進(jìn)行雜交來進(jìn)行遺傳改良的潛力大。通川8號和萬源1號相似系數(shù)為0.840 9，親緣關(guān)系最近，生活在不同縣區(qū)，可能來源于同一親本。

大竹雞心李作為22分材料中唯一果肉為紅色的材料，在聚類分析中并沒有單獨(dú)成為一類，而是與來源地相同的其他材料聚為一類。表明李種質(zhì)資源的分類與果肉顏色無明顯的相關(guān)性。

3 討論與結(jié)論

3.1 SRAP在李資源分析中應(yīng)用的可行性

國內(nèi)外學(xué)者研究表明，SRAP在形態(tài)學(xué)變異和形態(tài)學(xué)發(fā)展史上比AFLP更具有一致性[9]；比RAPD表現(xiàn)更穩(wěn)定[16]，更有利于遺傳育種評價(jià)；擴(kuò)增的條帶數(shù)和多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)[17]更豐富；能夠更好地區(qū)分近源種[18]。SRAP是評價(jià)遺傳多樣性、品種鑒定有效的手段。本研究表明，SRAP分子標(biāo)記用不同引物擴(kuò)增出的條帶清晰，條帶多形態(tài)性信息含量豐富，進(jìn)行UPGMA法聚類分析，同一果形的變異單系聚為一類，分類結(jié)果與果形相符，具有近似熟期的變異單系以及在同一地理位置的變異單系基本聚在一起，分類結(jié)果與熟期、資源地理分布基本相符，說明SRAP用于探討巴山脆李及達(dá)州地區(qū)優(yōu)良脆李資源間的親緣關(guān)系是可行的，能夠在探討中國李親緣關(guān)系中進(jìn)行應(yīng)用。

3.2 李種質(zhì)間的親緣關(guān)系

巴山脆李是青脆李的實(shí)生變異通過審定的品種[1]。經(jīng)過多年觀察比較，該品種比親本青脆李成熟期延后約30 d；果實(shí)為圓形，果頂微凹，而青脆李果形為扁圓形，果頂平；果實(shí)較大，平均單果重約40 g，而親本‘青脆李的平均單果質(zhì)量只有30 g左右；在達(dá)州海拔700 m的地方栽植，果實(shí)于8月中旬成熟，在自然條件下，果實(shí)貨架期可達(dá)10 d左右。本實(shí)驗(yàn)分子標(biāo)記結(jié)果顯示，來自同一縣區(qū)的種質(zhì)資源聚在一起，表明巴山脆李與通川區(qū)其他種質(zhì)有著較近的親緣關(guān)系，但在相似系數(shù)SM=0.72處巴山脆李從通川區(qū)種質(zhì)中分離出來，獨(dú)立成為一組，表明巴山脆李的基因水平雖然與通川區(qū)其他種質(zhì)相似，但也存在部分差異。對巴山脆李遺傳背景的研究，筆者認(rèn)為可結(jié)合SRAP分子標(biāo)記技術(shù)和其他分子標(biāo)記對通川區(qū)其他種質(zhì)資源和巴山脆李做進(jìn)一步分析。同一縣區(qū)的種質(zhì)資源親緣關(guān)系較近，推測是來源比較近或長期實(shí)生繁殖的原因，顯示出較近的遺傳距離，應(yīng)適當(dāng)引入國內(nèi)外優(yōu)質(zhì)李品種，擴(kuò)大當(dāng)?shù)乩钯Y源的遺傳多樣性，降低生態(tài)系統(tǒng)性風(fēng)險(xiǎn)。

3.3 本實(shí)驗(yàn)存在的不足

聚類結(jié)果顯示通川8號與萬源1號有著很近的親緣關(guān)系。但通川8號來源于達(dá)州市通川區(qū)海拔300 m左右的低海拔地區(qū)，于8月中下旬成熟，屬于中熟或中晚熟種質(zhì)資源，萬源1號來源于萬源市海拔1 000 m左右的地區(qū)，是9月中下旬成熟的晚熟種質(zhì)。通川8號的平均單果質(zhì)量明顯大于萬源1號。兩者局部外部形態(tài)學(xué)差異可能來源于外界生存環(huán)境條件差異，或者是變異差異點(diǎn)檢測不完全，這還需要進(jìn)一步探討。

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