張卓 許莉萍 陳平華等

摘 要 以單子葉植物常見外源轉(zhuǎn)基因元件Ubiquitin啟動子、NOS啟動子、NOS終止子、Bar基因和Bt基因序列設(shè)計多重PCR引物，通過對PCR擴(kuò)增體系中退火溫度、Premix TaqTM濃度、引物濃度的優(yōu)化，建立一種快速檢測轉(zhuǎn)基因甘蔗成分的多重PCR方法。結(jié)果表明：建立的體系一次能有效檢測5個參數(shù)，其檢測的最低DNA質(zhì)量百分比可達(dá)1.0%，并在多個轉(zhuǎn)基因甘蔗品種檢測中得到驗證。

關(guān)鍵詞 多重PCR；甘蔗；轉(zhuǎn)基因檢測

中圖分類號 S566.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

自20世紀(jì)80年代獲得第一例轉(zhuǎn)基因植株以來，轉(zhuǎn)基因作物的種植面積迅速擴(kuò)大。據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)推廣與應(yīng)用協(xié)會（ISAAA）統(tǒng)計，2012年全球28個國家的1 730萬農(nóng)民種植轉(zhuǎn)基因作物1.7億hm2，其中中國種植面積達(dá)400萬hm2，全球排名第六[1]。甘蔗（Saccharum Complex）是最主要的糖料作物， 蔗糖占世界食糖總產(chǎn)量的76%，占中國食糖總產(chǎn)量的90%以上[2-3]。目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)已廣泛應(yīng)用于甘蔗的遺傳育種，2011年高世武等[4]通過PPT篩選得到了轉(zhuǎn)Bt基因（抗螟蟲）和Bar基因（抗除草劑）的雙抗轉(zhuǎn)基因甘蔗。2012年董麗莎等[5]根據(jù)甘蔗黃葉病毒CP基因構(gòu)建RNAi載體，并成功轉(zhuǎn)化甘蔗。然而，隨著《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》的出臺[6]，轉(zhuǎn)基因檢測的方法越來越受到廣泛關(guān)注。

對于轉(zhuǎn)基因生物的檢測，目前國內(nèi)外實驗室和檢測部門應(yīng)用最廣泛的還是核酸PCR技術(shù)。對于具有多種外源基因元件序列的轉(zhuǎn)基因生物，通常采用對每個元件進(jìn)行一次PCR檢測的方式，這樣不僅耗時，而且也大幅度增加了檢測的成本[7]。同時，為了避免多價轉(zhuǎn)基因作物的多個外源基因之間產(chǎn)生“反式失活”[8]，人們在轉(zhuǎn)基因作物育種中，一般采用避免使用相同啟動子的做法[9]，這樣又進(jìn)一步增加了多抗轉(zhuǎn)基因作物檢測的靶序列。近年來，多重 PCR 技術(shù)在食品微生物和動物病原檢測上已有相關(guān)報道[10-11]，同時在植物轉(zhuǎn)基因檢測方面也獲得了一定的進(jìn)展。2005年徐景升等[12]建立了檢測轉(zhuǎn)基因大豆的多重PCR體系，同年Forte等[13]用多重PCR技術(shù)檢測大豆和玉米的外源基因；2008年高玉龍等[14]利用多重 PCR 技術(shù)成功檢測到轉(zhuǎn)基因煙草中的外源基因；2011年陳貞等[15]通過優(yōu)化的多重PCR體系，成功檢測出轉(zhuǎn)基因菜籽粕中的外源基因；2013年徐方嬌等[16]建立了檢測轉(zhuǎn)基因棉花的多重PCR體系；2013年邱良焱等[17]建立了檢測轉(zhuǎn)Bar、Bt基因雙抗稻米的多重PCR體系。本實驗室創(chuàng)制了轉(zhuǎn)Bar基因和Bt基因雙價轉(zhuǎn)基因甘蔗[4]，在一個轉(zhuǎn)化體中，同時含有Ubiquitin啟動子、NOS啟動子、NOS終止子、Bar基因和Bt基因序列，然而，一次同時檢測這5個參數(shù)的多重PCR技術(shù)研究尚未見報道。為了提高PCR效率，市場上出現(xiàn)了用高保真Taq酶、PCR buffer和染料混合配制的2倍PCR反應(yīng)液Premix TaqTM，PCR檢測過程無需配制反應(yīng)液和添加染料等步驟，節(jié)省了時間。如使用Premix TaqTM建立多重PCR技術(shù)，則可大幅度提高PCR檢測的效率，但目前未見有相關(guān)研究報道。甘蔗屬異源多倍體植物，由于染色體數(shù)目多且遺傳機(jī)制十分復(fù)雜，轉(zhuǎn)基因甘蔗的檢測仍存在一定的難度，多重PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因甘蔗檢測方面還未見報道。鑒于此，本實驗以多價轉(zhuǎn)基因甘蔗為材料，通過對影響多重PCR主要因素的優(yōu)化，建立一種快速、高效的轉(zhuǎn)基因甘蔗檢測方法，以提高轉(zhuǎn)基因甘蔗的檢測效率，為轉(zhuǎn)基因甘蔗的分子育種和檢測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 參照Biospin植物基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，柱洗脫產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL 離心管中，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA提取物質(zhì)量的測定 用TU-1810PC型紫外分光光度計檢測提取的DNA模板的濃度和純度，A260 nm/A280 nm比值在1.7～2.0范圍內(nèi)的樣品用于PCR檢測模板，并將模板濃度調(diào)整到50 ng/μL[18]。

備用。

對照。

PCR反應(yīng)體系：Premix TaqTM 15 μL， 上、 下游引物各0.6 μL， 模板3 μL（50 ng/μL），用ddH2O將終體積調(diào)整到30 μL。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，36個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 多重PCR體系的優(yōu)化 多重PCR反應(yīng)體系參考Henegariu的方法[21]，PCR反應(yīng)總體積為30 μL，模板為3 μL（50 ng/μL），以表2中各引物對按1 ∶ 1配比混合[22]。

不同Premix TaqTM含量與退火溫度對多重PCR的影響：多重PCR反應(yīng)中多種引物共用同一套模板，有多條擴(kuò)增條帶，Taq酶的用量較多；加上不同PCR引物的理論Tm值不同，因此Taq酶含量與退火溫度是影響多重PCR反應(yīng)的2個關(guān)鍵因素。為了確定合適的Premix TaqTM用量和多重PCR最適退火溫度，本實驗設(shè)計了40%、50%和60%共3種Premix TaqTM添加體積，并分別設(shè)立了60、58、56、55 ℃共4種退火溫度，其余反應(yīng)條件及電泳檢測方法與1.2.4中相同。

不同Premix TaqTM含量與引物濃度對多重PCR的影響：多重PCR反應(yīng)中不同引物共存于同一個反應(yīng)體系中，共用同一套模板，Taq酶的用量與引物濃度也是影響多重PCR反應(yīng)的2個重要因素。為探究不同Premix TaqTM含量和引物濃度對多重PCR的影響，本實驗對40%、50%和60% 3種Premix TaqTM添加體積分別設(shè)立了0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L共5種引物濃度，其余反應(yīng)條件及電泳檢測方法與1.2.4中相同。

1.2.6 DNA模板含量對多重PCR體系的影響 多重PCR擴(kuò)增的目的條帶多，在優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系中，如果DNA模板含量過低，依然有可能影響檢測結(jié)果。為確定多重PCR能檢測的合適DNA量，將相同濃度的轉(zhuǎn)基因株系FNSC15229與非轉(zhuǎn)基因供體FN15的基因組DNA按不同體積比混合，使樣品中轉(zhuǎn)基因DNA質(zhì)量百分比分別為3.0%、2.0%、1.0%、0.5%，以FNSC15229的基因組DNA為對照，進(jìn)行多重PCR檢測，根據(jù)目的條帶的擴(kuò)增情況判定合適DNA量。

1.2.7 多重PCR體系驗證 為了驗證所建立的多重PCR反應(yīng)體系的可靠性，用已知外源目的基因元件的轉(zhuǎn)基因甘蔗福農(nóng)95-1702和桂糖94-119[4]及FNSC15229、FNSC22229和FNSC30229為材料，進(jìn)行多重PCR檢測，根據(jù)目的條帶的擴(kuò)增情況，判定建立的多重PCR反應(yīng)體系的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因和調(diào)控因子單重PCR檢測

利用表2中的PCR引物，以轉(zhuǎn)基因甘蔗FNSC15229的DNA為模板，以非轉(zhuǎn)基因甘蔗FN15為陰性對照，ddH2O為空白對照，分別進(jìn)行Ubiquitin啟動子、NOS啟動子、NOS終止子、Bar基因和Bt基因PCR檢測，結(jié)果各轉(zhuǎn)基因元件均呈陽性，與已知的FNSC15229轉(zhuǎn)基因成分一致。由圖1可以看出，PCR產(chǎn)物特異性強，無可見的非特異條帶，擴(kuò)增效率高；與表1和表2對比可以看出，PCR檢出的元件和產(chǎn)物大小都與預(yù)期的一致，這表明所設(shè)計的各引物均具有較好的特異性，可用于轉(zhuǎn)基因的檢測。同時將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序和BLAST對比，擴(kuò)增產(chǎn)物堿基序列與已知序列一致，證實PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確為目的擴(kuò)增片段。

2.2 不同Premix TaqTM含量與退火溫度對多重PCR的影響

2.3 不同Premix TaqTM含量與引物濃度對多重PCR的影響

2.4 DNA模板含量對多重PCR體系的影響

2.5 多重PCR體系驗證

3 討論與結(jié)論

本實驗通過PCR反應(yīng)組分優(yōu)化，建立了可同時檢測轉(zhuǎn)基因甘蔗外源Bar基因、Bt基因、Ubiquitin啟動子、NOS啟動子和NOS終止子的5重PCR反應(yīng)體系，確定了60%的Premix TaqTM添加體積比、0.3 μmol/L的各引物濃度、56 ℃的退火溫度為5重PCR反應(yīng)體系的最適條件。通過改變作為模板的轉(zhuǎn)基因甘蔗基因組DNA的含量并利用已知轉(zhuǎn)基因甘蔗為模板，對所建立的5重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行驗證，結(jié)果證明該PCR反應(yīng)體系也適用于其它轉(zhuǎn)基因甘蔗品系。上述5種轉(zhuǎn)基因成分檢測中，轉(zhuǎn)基因樣品DNA質(zhì)量百分比要求達(dá)到1.0%以上。

本實驗對轉(zhuǎn)基因研究中常見的外源調(diào)控因子Ubiquitin啟動子、NOS啟動子、NOS終止子及外源基因Bar和Bt建立了5重PCR體系，尤其是Ubiquitin啟動子在單子葉植物轉(zhuǎn)基因研究中經(jīng)常使用，因此本方法在單子葉植物轉(zhuǎn)基因檢測中更有優(yōu)勢；雖然目前有見含Ubiquitin啟動子的多重PCR方法，但需要進(jìn)行2次多重PCR方法才能完成[17]，本體系只需1次PCR反應(yīng)就能完成5種常見轉(zhuǎn)基因元件的檢測，有更高的實用價值。

多重PCR是在同一反應(yīng)體系中加入多對引物，獲得多個片段的特異性擴(kuò)增。因此，引物組合設(shè)計時，應(yīng)盡量控制各引物間的Tm值，以便更好設(shè)計PCR的退火溫度。本實驗使用的檢測引物中，Bar基因檢測引物參照進(jìn)出口檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[20]，Ubiquitin啟動子參照本實驗室的研究結(jié)果[19]，而NOS啟動子參照農(nóng)業(yè)部頒布的轉(zhuǎn)基因檢測國家標(biāo)準(zhǔn)[23]，但為了PCR擴(kuò)增片段相互分開，引物序列有調(diào)整。其余引物均由本實驗自行設(shè)計。

在建立多重PCR反應(yīng)體系過程中，即使使用同樣的DNA模板，并在優(yōu)化的條件下，各目的條帶擴(kuò)增效果仍然達(dá)不到進(jìn)行單對引物PCR反應(yīng)時各目的條帶擴(kuò)增的均一性，說明多重PCR反應(yīng)中各對引物之間存在復(fù)雜的競爭關(guān)系。

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責(zé)任編輯：黃東杰