黨轉(zhuǎn)寧等

摘要 [目的]建立H2O2誘導HaCaT細胞氧化應(yīng)激損傷的體外模型，探討扇貝多肽（PCF）對H2O2損傷HaCaT細胞的保護作用及其作用機制。

[方法]采用不同濃度的H2O2（50、100、200、300、500 μmol/L）作用HaCaT細胞12 h后，采用CCK-8法檢測細胞存活率；用不同濃度（1.42、2.84、5.68 mmol/L）的PCF分別處理細胞12 h后，加入H2O2（300 μmol/L）繼續(xù)作用12 h，采用CCK-8法檢測細胞活力，采用酶生化法法測定細胞上清液中LDH活性以及細胞質(zhì)中GSH-Px、T-AOC和CAT水平。[結(jié)果]與正常組相比，50～500 μmol/L濃度的H2O2依賴性地引起HaCaT細胞氧化損傷，300 μmol/L 的H2O2使存活率降低到56%（P<0.01）；與模型組相比，不同濃度的PCF均可保護H2O2誘導的氧化損傷，增加細胞存活率，降低細胞LDH的釋放量，提高GSH-Px、T-AOC和CAT含量，增強細胞抗氧化作用。[結(jié)論]扇貝多肽能對抗H2O2誘導的氧化應(yīng)激，對細胞受損具有保護作用，其機制可能與提高抗氧化酶活力有關(guān)。

關(guān)鍵詞 扇貝多肽；H2O2；HaCaT細胞；氧化應(yīng)激

中圖分類號 S965.3+9 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）20-06618-03

Protective Effect of PCF on H2O2induced HaCaT Cell Injury

DANG Zhuanning， HAN Yantao et al

（Medical College of Qingdao University， Qingdao， Shandong 266071）

Abstract [Objective] To establish in vitro model of H2O2induced oxidative stress damage of HaCaT cells， and investigate the polypeptide from Chlamys farreris protective effect and its possible mechanism on H2O2induced damage to HaCaT cells. [Method] Cell Counting Kit8（CCK8） was used to test the cell survival rate of different concentrations （50， 100， 200， 300， 500 μmol/L） H2O2 for 12 h on HaCaT cells； different concentrations （1.42， 2.84， 5.68 mmol/L） PCF treated cell for 12 h， and then the appropriate H2O2 concentration （300 μmol/L） were adopted to treat， CCK8 was used to detect the cell viability. Enzyme biochemical method was applied to detect the activity of LDH in culture supernatants， GSHPx， TAOC and CAT levels in cell lysis solution. [Result] Compared with control group， at 50-500 μmol/L， H2O2 caused concentrationdependent oxidative damage in the HaCaT cell， at 300 μmol/L H2O2 decreased the cell survival rate to 56% （P<0.01）； Compared with model group， all different concentration PCF protected HaCaT cells from oxidative damage induced by H2O2， significantly increased the cell survival rate， decreased the release of LDH and increase GSHPx， TAOC and CAT level， enhanced antioxidation effect of HaCaT cell. [Conclusion] PCF has the significant protective effects on HaCaT cells injured by H2O2， which may be associated with the increased of antioxidase activity.

Key words Polypeptide from Chlamys farreri； H2O2； HaCaT cell； Oxidative stress

人皮膚長期暴露在外界理化環(huán)境中會受到各種損害，角質(zhì)形成細胞（HaCaT細胞）是構(gòu)成人最外層皮膚的主要細胞，為機體和外界提供了一個天然的屏障。機體在短期的氧化環(huán)境中暴露，能產(chǎn)生活性氧（ROS），可以依靠自身的抗氧化機制清除，維持氧化與抗氧的平衡狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過長期的紫外線（UV）照射，機體會產(chǎn)生過量的ROS，氧化和損傷細胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白和DNA，并對皮膚產(chǎn)生有害影響，包括致癌、炎癥、日光性紅斑和早衰[1-2]。例如，Park等發(fā)現(xiàn)過量的UVB照射小鼠背部皮膚后引發(fā)小鼠表型的改變[3]。ROS通常包括1O2、O2-·、·OH和H2O2等，有研究表明，在HaCaT細胞內(nèi)1O2可以氧化損傷細胞結(jié)構(gòu)，改變線粒體電位和溶酶體穩(wěn)定性[4-5]。筆者通過使用H2O2這種重要的活性氧為誘導劑，建立H2O2對HaCaT細胞氧化損傷的模型，旨在為抗氧化藥物對UV造成的氧化應(yīng)激損傷提供新的可能的治療。

1 材料與方法

1.1 材料

人角質(zhì)形成細胞（HaCaT細胞 ，北京協(xié)和醫(yī)院）；H2O2（Sigma公司）；RPMI-1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶、胎牛血清（Hyclone）；CCK-8細胞增殖-毒性檢測試劑盒（購自日本Dojindo公司）；BCA蛋白定量試劑盒（購自碧云天生物技術(shù)研究所）；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測試盒、總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）測試盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1

細胞培養(yǎng)。

HaCaT細胞培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于含5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h換液1次，待細胞長到80%～90%時，吸取瓶中培養(yǎng)液，用PBS沖洗2遍，用濃度0.25%的胰酶和0.02%EDTA消化細胞，于1 000 r/min離心5 min后棄上清，加入適量培養(yǎng)液吹打成細胞懸液，1∶2傳代。

1.2.2

H2O2損傷模型的建立。

取對數(shù)生長期的細胞每孔5 000個接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μl細胞懸液，分別設(shè)置空白組、正常對照組、不同濃度H2O2 （50、100、200、300、500 μmol/L）組，每組設(shè)6個復孔，待細胞長至80%時，用H2O2處理12 h。然后，每孔加入10 μl CCK-8，培養(yǎng)箱中孵育3 h，使用酶標儀讀取波長450 nm處OD值。按照以下公式計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（OD試驗組-OD空白對照組）/（OD對照組-OD空白對照組）×100%。

1.2.3

藥物對細胞存活率的影響。取對數(shù)生長期的細胞每孔5000個接種于96孔板中，待細胞生長至70%～80%時， 隨機分為6組：空白組、正常對照組、模型組和藥物組。正常組正常培養(yǎng)，藥物組先分別加入含終濃度為1.42、2.84和5.68 mmol/L PCF的培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)12 h后，棄掉，再向模型組和藥物組內(nèi)分別加入含終濃度為300 μmol/L H2O2的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，每組加入10 μl CCK-8，培養(yǎng)箱中孵育3 h，使用酶標儀檢測細胞存活率。

1.2.4

細胞上清液中LDH活力的檢測。取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中，分別設(shè)立正常對照組、模型組和不同濃度的藥物組，按照“1.2.3”中方法處理后，收集各組細胞上清液，按照試劑盒說明書操作檢測LDH活力。每組設(shè)3次重復。

1.2.5

細胞中GSHPx、TAOC和CAT水平的檢測。取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中，分別設(shè)正常對照組、模型組和不同濃度的藥物組，按“1.2.3”方法處理后，收集各組細胞，按照試劑盒說明書操作檢測GSH-Px、T-AOC和CAT水平。每組設(shè)3個重復。

1.2.6

數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析，結(jié)果以均值±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗，各組之間多重比較采用 LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度H2O2對HaCaT細胞存活率的影響

從圖1可以看出，不同濃度（50、100、200、300、500 μmol/L）的H2O2對HaCaT細胞的存活有一定的影響。與正常組相比，細胞存活率情況與H2O2呈現(xiàn)濃度依賴性，表現(xiàn)出氧化損傷趨勢。當H2O2濃度為300 μmol/L時，細胞的存活率為正常組的

注：*表示與對照差異顯著（P<0.05）；**表示與對照差異極顯著（P<0.01）。

圖1 不同濃度的H2O2對HaCaT細胞存活率的影響

56%，差異極顯著（P<0.01）。因此，選擇300 μmol/L的H2O2作用12 h，建立氧化損傷模型。

2.2 不同濃度PCF對H2O2誘導的 HaCaT細胞存活率的影響

從圖2可以看出，不同濃度（1.42、2.84、5.68 mmol/L）的PCF對受損的HaCaT細胞存活率表現(xiàn)出一定的保護作用，且隨著PCF濃度的升高，細胞存活率也呈梯度上升。與模型組相比，1.42、2.84和5.68 mmol/L的PCF將HaCaT細胞存活率由模型組的55.30%分別提高到60.70%、73.07% 和87.52%，差異顯著（P<0.05）。

注：**表示與對照差組異極顯著（P<0.01）；△表示與模型組差異顯著（P<0.05）；△△表示與模型組差異極顯著（P<0.01）。

圖2 不同濃度PCF對H2O2誘導的 HaCaT細胞存活率的影響

2.3 不同濃度PCF對H2O2誘導的 HaCaT細胞LDH釋放量的影響

由表1可知，與對照組比較，模型組LDH水平顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，不同濃度的PCF均可降低LDH釋放量，5.68 mmol/L的PCF可將LDH釋放量降低到37.9%，存在顯著差異（P<0.01）。

2.4 不同濃度PCF對H2O2誘導的 HaCaT細胞GSH-Px、T-AOC、CAT和LDH水平的影響

3 討論

筆者通過不同濃度的H2O2對HaCaT細胞進行氧化損傷，采用CCK-8法檢測細胞存活率，因為CCK-8內(nèi)水溶性四唑鹽WST-8被細胞內(nèi)脫氫酶氧化還原后生成橙黃色甲臜染料可溶解在培養(yǎng)液中，生成的甲臜量與活細胞數(shù)成正比，所以可根據(jù)染料顏色程度反映細胞的存活狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，當H2O2濃度為300 μmol/L時，細胞存活率達到56%，則選擇H2O2濃度為300 μmol/L，作用12 h為氧化損傷模型。PCF是從櫛孔扇貝中提取，含有8個氨基酸的水溶性小分子多肽[6-7]。該研究表明 1.42、2.84和5.68 mmol/L的PCF分別將細胞存活率提高到60.70%、73.07%和87.52%，說明PCF對H2O2誘導的HaCaT細胞氧化應(yīng)激有一定的保護作用。

LDH是存在于細胞內(nèi)的一種糖酵解酶，可以間接反映細胞氧化應(yīng)激受損的程度。當細胞膜受到氧化攻擊可使膜通透性變大或破壞時，LDH可透過細胞膜滲出[8]。筆者通過收集細胞上清液，通過檢測LDH活力發(fā)現(xiàn)，模型組LDH水平明顯高于正常組，表明HaCaT細胞在受到H2O2的攻擊后，細胞膜受損，通透性增大，上清中LDH釋放增多，細胞活性下降。加入不同濃度的PCF后，LDH釋放減少，表明PCF可對抗H2O2對HaCaT細胞的氧化損傷，保護細胞膜的完整性。

H2O2是一種強氧化劑，尤其可以氧化生物膜脂[9]，其作為活性氧家族的重要一員，對細胞的氧化應(yīng)激作用已多有報道。GSH-Px、CAT和T-AOC是細胞內(nèi)重要的抗氧化防御系統(tǒng)，對細胞的氧化具有保護作用。CAT對H2O2具有特異性，可將H2O2分解為水和氧，不需要輔助因子即可對進行H2O2清除，并且隨著H2O2濃度的增大，其酶活性也將增大[10]。該研究發(fā)現(xiàn)，300 μmol/L的H2O2可使細胞氧化受損后，胞內(nèi)CAT水平降低，而加入PCF后各組細胞內(nèi)PCF水平明顯升高，且與PCF具有濃度依賴性。這表明PCF可提高胞內(nèi)CAT活性，增強細胞抗氧化能力，對細胞氧化應(yīng)激有一定的保護作用。GSH-Px是機體內(nèi)重要的氧化防御指標之一[11]，可特異地催化還原型GSH對H2O2的還原反應(yīng)，降低H2O2水平，是一種胞內(nèi)重要的分解H2O2的酶；T-AOC可以反映機體的總抗氧化能力。該研究結(jié)果表明，與模型組相比，藥物組加入PCF后，胞內(nèi)GSH-Px和T-AOC水平升高，說明PCF有提高酶活力的作用。

綜上所述，H2O2能夠成功誘導HaCaT細胞氧化損傷，而PCF可以降低細胞上清中LDH含量，增強GSH-Px、T-AOC、和CAT活性，抵抗細胞脂質(zhì)和蛋白過氧化，保護細胞完整性。該研究為PCF的抗氧化效應(yīng)提供了理論依據(jù)，其機制可能與提高抗氧化酶活力有關(guān)。

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