蔡金森等

摘 要 CaDREB3是辣椒DREB家族中1個(gè)成員，為明確CaDREB3受逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的分子機(jī)制，從辣椒基因組DNA中分離獲得了CaDREB3上游的啟動(dòng)子，利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行順式作用元件的分析，結(jié)果表明該啟動(dòng)子的TATA框?yàn)槠鹗济艽a子ATG上游-89 bp至-86 bp的TATA，同時(shí)含有多種與逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件，如ABRE、HSE、MYB和TCA等，并使用Gateway技術(shù)構(gòu)建了啟動(dòng)子6個(gè)缺失體的GUS融合載體，獲得了6個(gè)缺失體的煙草轉(zhuǎn)基因植株，這些結(jié)果為將來(lái)分析該啟動(dòng)子應(yīng)答逆境脅迫的調(diào)控區(qū)域奠定了一定的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 DREB轉(zhuǎn)錄因子；Genome Walking；啟動(dòng)子

中圖分類號(hào) Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract CaDREB3 is a member of the DREB family in pepper. In order to further clarify the molecular mechanism of the stress-induced expression of CaDREB3， we isolated the upstream promoter of CaDREB3 from pepper genomic DNA. Bioinformatics analysis illustrated that the TATA box located from -89 bp to -86 bp， upstream from start codon（ATG）， and a variety of stress-associated cis-acting elements were included， such as ABRE， HSE， MYB and TCA， etc. Five deletions fused to GUS--reported gene of CaDREB3 promoter were constructed via Gateway technology and transgenic plants of the six deletions were generated. Taken together， the results above lay the foundation to determine the regulatory region of the promoter response to stress.

Key words DREB transcription factor； Genome walking； Promoter

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.020

植物在長(zhǎng)期進(jìn)化中逐漸建立起的抗逆機(jī)制使植物在遭遇如干旱、鹽漬、低溫等外界環(huán)境引起的脫水反應(yīng)時(shí)啟動(dòng)耐脫水相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)代謝和生理上的變化，最終提高植物對(duì)逆境的耐性或抗性[1]。DREBP（Dehydration Responsive Element Binding protein）即干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白質(zhì)[2-3]，歸屬于AP2/EREBP（ethylene responsive element）這一植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，該家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，通過(guò)識(shí)別與結(jié)合DRE/CRT（dehydration responsive element/C-repeat）順式作用元件，調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá)來(lái)參與花的發(fā)育[12]、細(xì)胞增殖[11]、逆境脅迫、ABA反應(yīng)[14]、乙烯反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程[4-5]。大量的研究結(jié)果表明，AP2/EREBP一般都表現(xiàn)出顯著的誘導(dǎo)表達(dá)特征，即在不同的逆境脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)[6]，這種誘導(dǎo)表達(dá)顯然是長(zhǎng)期進(jìn)化形成的經(jīng)濟(jì)有效的抗逆策略，既實(shí)現(xiàn)了對(duì)逆境的耐性，又可在逆境解除時(shí)及時(shí)關(guān)閉防御反應(yīng)以減少物質(zhì)能力的不必要消耗。因此，分析防御反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，不但有助于解析基因功能，還可為在基因工程中實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因表達(dá)的有效調(diào)控策略的制定提供依據(jù)，而啟動(dòng)子分離及其順式作用原件的5′缺失突變體分析是揭示基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的重要途徑。

CaDREB3是辣椒DREB家族的一個(gè)成員[7]，筆者的前期研究結(jié)果表明CaDREB3在高鹽和機(jī)械損傷的脅迫下轉(zhuǎn)錄水平得到明顯的提高，表明該基因在植物中應(yīng)答高鹽和機(jī)械損傷等逆境的crosstalk中起重要調(diào)節(jié)作用，但對(duì)其誘導(dǎo)表達(dá)的分子機(jī)制還不很清楚。為了進(jìn)一步明確CaDREB3受逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的分子機(jī)制，本研究從辣椒基因組DNA中分離獲得了CaDREB3的相應(yīng)啟動(dòng)子，開展本研究不僅有利于闡明CaDREB3誘導(dǎo)型防御反應(yīng)的分子機(jī)制，還可望為誘導(dǎo)型合成啟動(dòng)子的構(gòu)建提供有利用價(jià)值的元件，為作物抗逆基因工程遺傳改良提供有利用價(jià)值的啟動(dòng)子。

1 材料與方法

1.1 材料

福建地方栽培品種朝天椒L11、野生型煙草品種大金元、pMDC163載體、E. coli DH-10B、Agrobacterium EHA105菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。Genome Walking Kit購(gòu)自加拿大Bio S&T公司，DNA marker、rTaq聚合酶、限制性內(nèi)切酶等均購(gòu)自TaKaRa大連寶生物工程有限公司，Gateway試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，瓊脂糖購(gòu)自Amresco公司，質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒均購(gòu)自天根生物公司，各種抗生素以及X-Gluc購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。其他均為國(guó)產(chǎn)分析純或者化學(xué)純藥品。

1.2 方法

1.2.1 CTAB法提取辣椒基因組DNA 取2～3 g幼嫩辣椒葉片，在始終存在液氮的研缽中研磨成粉末，粉末轉(zhuǎn)到含有65 ℃預(yù)熱的1.5×CTAB溶液的1.5 mL離心管中，混勻，65 ℃水浴30 min（每5 min顛倒離心管1次），室溫下12 000 ×g離心5 min，上清移到新的1.5 mL離心管，加入等體積的酚氯仿（25 ∶ 24 ∶ 1），混勻，室溫下12 000 ×g離心5 min，取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇（24 ∶ 1），顛倒數(shù)次，室溫下12 000 ×g離心5 min，取上清加入1/100體積的RNaseA溶液，37 ℃放置30 min。加入1/10體積的醋酸鈉和2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻，室溫放置10 min，12 000 ×g離心10 min，取上清，用1 mL 75%乙醇洗滌沉淀2次，吹干后加入無(wú)菌水溶解DNA即辣椒基因組DNA。

1.2.2 Genome Walking方法分離CaDREB3基因的啟動(dòng)子 CTAB法提取辣椒基因組DNA后使用Genome Walking[8]來(lái)分離克隆CaDREB3基因的啟動(dòng)子序列。

1.2.3 對(duì)獲得啟動(dòng)子進(jìn)行測(cè)序和順式作用元件的分析 擴(kuò)增得到的啟動(dòng)子片段克隆到TaKaRa公司的測(cè)序載體pMD18-T，挑取陽(yáng)性克隆送往華大基因公司進(jìn)行測(cè)序，獲得的啟動(dòng)子序列在順式作用元件軟件（在PLANTCARE網(wǎng)站http：// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/.及PLACE網(wǎng)站http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html.）進(jìn)行順式作用元件的分析。

1.2.4 啟動(dòng)子GUS融合載體和5'一系列缺失體的構(gòu)建 根據(jù)Invitrogen的專利Gateway技術(shù)把啟動(dòng)子的各個(gè)缺失序列克隆到表達(dá)載體pMDC163，獲得各個(gè)缺失體的融合載體。所有的重組載體送往上海英俊公司進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)后均通過(guò)凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105菌株備用。

1.2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的CaDREB3的遺傳轉(zhuǎn)化 將收獲的煙草大金元野生型成熟種子用75%乙醇滅菌15 s，無(wú)菌水沖洗種子幾遍后用氯含量為2%的次氯酸鈉溶液消毒6～7 min，接著用無(wú)菌水沖洗種子幾遍后放于濾紙吸干，播種于空白MS培養(yǎng)基，待煙草長(zhǎng)至7～10葉期備用。將無(wú)菌煙草葉片剪成約1 cm2平鋪在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d。將含有融合載體的單克隆農(nóng)桿菌用50 mL液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至約OD600=0.6，將預(yù)培養(yǎng)的煙草葉片放入菌液中，緩慢的漩渦混勻7～8 min，將葉片置于滅菌過(guò)的濾紙上晾干，轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上，黑暗共培養(yǎng)2 d。將共培養(yǎng)的葉片用500 mg/L羧芐青霉素（Carb）水洗15 min左右，再用無(wú)菌水洗3～5遍后移到濾紙上晾干，放于含有潮霉素和羧芐青霉素的MS篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，一周繼代1次，直至長(zhǎng)出抗性小苗。將小苗移到含有頭孢霉素和潮霉素的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待長(zhǎng)出根后煉苗3～7 d，再移栽到缽中，用X-Gluc染色檢測(cè)或PCR驗(yàn)證，保留陽(yáng)性苗，收種。

1.2.6 GUS組織化學(xué)染色 用剪刀取下植株的部分葉片，浸泡在X-Gluc染色液（磷酸緩沖液：32 mL的0.02 mol/L磷酸氫二鈉二水與68 mL的0.02 mol/L十二水合磷酸二氫鈉混合調(diào)節(jié)pH=7.0，用1 mL DMSO溶解25 mg X-Gluc再與50 mL的磷酸緩沖液混合），于37 ℃條件下過(guò)夜染色。將染色后的煙草葉片轉(zhuǎn)入70%乙醇中脫色2～3次。脫色后，藍(lán)色部位即為GUS表達(dá)位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Genome Walking方法獲取CaDREB3基因的啟動(dòng)子序列

2.1.1 Genome Walking 1st PCR和2nd PCR巢式PCR 朝天椒L11基因組DNA用GSPa進(jìn)行單引物PCR并在反應(yīng)產(chǎn)物中直接加入隨機(jī)兼并引物DRT和聚合酶進(jìn)行超循環(huán)擴(kuò)增，以擴(kuò)增后的產(chǎn)物為模板和以GSPb為下游引物，UAP-N1為上游引物，進(jìn)行Genome Walking的1st PCR反應(yīng)，電泳結(jié)果如圖1；取1st PCR反應(yīng)液稀釋100倍作為模板，以GSPc和UAP-N2為引物，進(jìn)行2nd PCR，結(jié)果如圖2。

2.1.2 膠回收目的DNA并做電泳檢測(cè) 用手術(shù)刀割下圖2第1泳道的含目的DNA的瓊脂糖凝膠，使用膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收，回收到的目的DNA用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)圖如圖3。

2.2 CaDREB3基因啟動(dòng)子的序列分析

把獲得的啟動(dòng)子克隆到測(cè)序載體pMD18-T，選取陽(yáng)性克隆送往Invitrogen公司，把獲得的測(cè)序序列與CaDREB3基因的序列進(jìn)行比對(duì)，找出同源序列以確定CaDREB3轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)ATG上游的啟動(dòng)子序列，在順式作用元件分析網(wǎng)站PlantCARE。對(duì)獲得的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，找到了許多推定的與植物激素和逆境應(yīng)答相關(guān)元件（見圖4）。

2.3 啟動(dòng)子5′缺失體融合載體的構(gòu)建

根據(jù)生物信息學(xué)分析的啟動(dòng)子的順式作用元件分布情況，把啟動(dòng)子分為6段，并分別構(gòu)建6個(gè)缺失體的GUS融合載體，6個(gè)缺失體順式作用元件的分布情況如圖5，6個(gè)缺失體的融合載體分別轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌菌株EHA105用于瞬間表達(dá)分析。

2.4 CaDREB3基因啟動(dòng)子缺失體轉(zhuǎn)基因煙草的獲得

通過(guò)普通PCR法和GUS組織化學(xué)染色法相結(jié)合對(duì)獲得的CaDREB3啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行驗(yàn)證，挑選出2種檢測(cè)都為陽(yáng)性的植株栽培，收種。一共獲得了p1289缺失體5個(gè)，p1074缺失體6個(gè)，p903缺失體7個(gè)，p670缺失體7個(gè)，p431缺失體5個(gè)，p131缺失體6個(gè)T0代轉(zhuǎn)基因株系。

2.4.1 轉(zhuǎn)基因植株的PCR驗(yàn)證 運(yùn)用CTAB法提取篩選得到的抗性煙草苗葉片基因組DNA，以抗性煙草苗葉片基因組DNA作為模板，分別用潮霉素引物（HypF：5-TCgTTATgTTTATCggCACTTTg-3； HypR：5-gCgTCTgCTgCTCCATACAAg-3）對(duì)得到的基因組DNA進(jìn)行PCR后，進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖6，選出陽(yáng)性植株，分別是：p1289缺失體5個(gè)，p1074缺失體6個(gè)，p903缺失體7個(gè)，p670缺失體7個(gè)，p431缺失體5個(gè)，p131缺失體6個(gè)。同時(shí)設(shè)置野生大金元煙草苗葉片DNA為陰性對(duì)照，以重組目的基因的載體為陽(yáng)性對(duì)照。

2.4.2 轉(zhuǎn)基因植株的X-Gluc染色檢測(cè) 為了進(jìn)一步驗(yàn)證PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株的可靠性，進(jìn)一步用X-Gluc染色檢測(cè)啟動(dòng)子每個(gè)缺失體的一個(gè)株系進(jìn)行了檢測(cè)（部分染色結(jié)果如圖7），6個(gè)株系均可檢測(cè)到藍(lán)色底物，這說(shuō)明了CaDREB3啟動(dòng)子融合載體中的GUS報(bào)告基因已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)入大金元煙草基因組，即所得的煙草苗有轉(zhuǎn)基因苗。

3 討論與結(jié)論

對(duì)于大多數(shù)還未完成全基因組測(cè)序的物種來(lái)說(shuō)，分離特定基因的啟動(dòng)子仍然是一項(xiàng)十分重要而困難的工作。在本研究中采用了基因組步行（Genome Walking）法[9]，并對(duì)該方法進(jìn)行了以下方面的調(diào)整：（1）為了減少DNA模板的損傷，縮短了熱變性時(shí)間，由通常的30 s縮短為15 s；（2）加強(qiáng)了基因組DNA的純化，雜質(zhì)的存在將會(huì)大大影響整個(gè)擴(kuò)增效率；（3）適當(dāng)?shù)卦黾油嘶饡r(shí)間，由一般的30 s增加到2 min甚至更長(zhǎng)，以確保辣椒基因組DNA中靶序列與引物的充分結(jié)合。

信息學(xué)分析表明在CaDREB3起始密碼子ATG上游-89 bp至-86 bp處含有TATA框，此外，在該啟動(dòng)子區(qū)域還發(fā)現(xiàn)存在W盒、HSE、CGTCA-motif、TCA element， ABRE和MBS等多種與逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件。例如，W盒參與植物對(duì)病原菌侵染的應(yīng)答的信號(hào)傳導(dǎo)，HSE參與應(yīng)答植物高溫脅迫，SA元件（TCA element）及JA元件（CGTCA-motif）參與植物應(yīng)答生物和非生物逆境脅迫信號(hào)傳遞，ABRE是ABA應(yīng)答相關(guān)的元件，廣泛參與植物對(duì)非生物逆境及生物逆境脅迫應(yīng)答的信號(hào)傳導(dǎo)，TC-rich repeats是與防御反應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，這些元件的存在暗示CaDREB3可能不光與辣椒應(yīng)答脫水等非生物逆境相關(guān)，還可能在植物應(yīng)答病原菌等生物逆境脅迫以及植物在應(yīng)答生物和非生物逆境信號(hào)通路的交互作用（crosstalk）中起重要的調(diào)節(jié)作用。

本研究利用Genome Walking 技術(shù)從辣椒基因組DNA克隆得到CaDREB3基因5′端上游-1 289 bp的啟動(dòng)子調(diào)控序列，并構(gòu)建了CaDREB3啟動(dòng)子的6個(gè)5′缺失體（p1289、p1074、p903、p670、p431和p131），使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系分別轉(zhuǎn)化煙草品種紅花大金元，分別都獲得相應(yīng)的T0代轉(zhuǎn)基因植株（p1289缺失體5個(gè)，p1074缺失體6個(gè)，p903缺失體7個(gè)，p670缺失體7個(gè)，p431缺失體5個(gè)，p131缺失體6個(gè)），這些轉(zhuǎn)基因植株及其相應(yīng)的T1或T2代株系的獲得，將為進(jìn)一步分析不同元件的作用奠定重要的基礎(chǔ)。雖然前人的很多研究表明DREB參與了植物抗病[10-12]，抗機(jī)械損傷[13]以及抗鹽脅迫[14]等，但是對(duì)其上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制還不是很清楚，本研究獲得的CaDREB3啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因煙草可利用外源激素以及其他生物或非生物脅迫處理，進(jìn)行GUS定量分析，明確CaDREB3啟動(dòng)子應(yīng)答除脫水以外的生物或非生物脅迫的關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域，這為今后進(jìn)一步剖析CaDREB3的上游調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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