莊金秋等

摘 要：血凝抑制試驗是檢測有血凝性的家禽疾病抗體效價最常用的一種方法，具有簡便、快速、靈敏、準確等特點，已被廣泛應用于各獸醫(yī)檢測機構(gòu)和基層養(yǎng)禽場，但是由于試驗操作過程中的不規(guī)范操作和細節(jié)注意不夠，導致不正確檢測結(jié)果出現(xiàn)的現(xiàn)象時有發(fā)生，筆者結(jié)合工作實踐現(xiàn)將禽蛋卵黃抗體檢測過程中影響血凝抑制試驗結(jié)果的影響因素進行分析歸納總結(jié)，以期能對生產(chǎn)應用提供參考。

關鍵詞：卵黃抗體；血凝抑制試驗；檢測；影響因素

母雞被特定抗原免疫后，產(chǎn)生的特異性抗體除主要以IgG的形式存在于血清中，還可以儲存在卵黃中，被稱為卵黃抗體（IgY）。研究表明，新城疫或禽流感疫苗二免21d后（在有基礎免疫的情況下）卵黃抗體水平與血清抗體水平接近，卵黃抗體水平的大小直接反映了血清抗體水平的高低。在蛋禽疾病防治中，為了及時掌握禽流感、新城疫、產(chǎn)蛋下降綜合征等疫苗的免疫效果，了解產(chǎn)蛋家禽抗體水平的高低以便制定正確的免疫程序，臨床上需要對免疫家禽的卵黃抗體水平進行多次監(jiān)測。這在一定程度上避免了因采血測定血清抗體給家禽造成的應激反應，不致引起家禽產(chǎn)蛋量的下降。應用血凝抑制試驗（HI試驗）檢測禽蛋卵黃抗體水平是最簡便、經(jīng)濟、準確的血清學檢測方法。但在實際操作過程中，由于種種原因，常有檢測結(jié)果不準確或試驗失敗的現(xiàn)象發(fā)生，造成不能及時向送檢單位及時提供檢驗數(shù)據(jù)，進而給蛋雞生產(chǎn)但來不必要的損失。筆者結(jié)合工作實踐現(xiàn)將禽蛋卵黃抗體檢測過程中影響血凝抑制試驗結(jié)果的影響因素分析歸納總結(jié)如下，以期為臨床抗體檢測工作者提供參考。

1 試劑的配制與貯存

1.1 抗凝劑 抗凝劑可選用阿氏液或3.8%的枸櫞酸鈉（檸檬酸鈉）。阿氏液含有枸櫞酸鈉和細胞需要的養(yǎng)分葡萄糖，配制方法為：稱取葡萄糖2.05g，檸檬酸鈉0.8g，檸檬酸0.055g，氯化鈉0.42g，加超純水至100ml，加熱溶解后將pH值調(diào)到6.1，經(jīng)116℃、20min的高壓滅菌，于4℃保存?zhèn)溆?。阿氏液pH過低會引起紅細胞凝固。3.8%的枸櫞酸鈉配制簡單，高壓滅菌后同樣置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 稀釋液 常用的稀釋液為滅菌的磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L，pH7.2 PBS）和生理鹽水（0.85%NaCl溶液），其pH值應控制在7.0～7.2。PBS對其它酸堿物質(zhì)具有較強的緩沖能力，可以維持反應體系的酸堿度，提高試驗的準確性。病毒的血凝性一般在pH4.5～7.8較穩(wěn)定，最適pH范圍為6.0～7.2。PBS的pH在5.8以下，紅細胞易自凝；pH在7.8以上，吸附于紅細胞上的病毒易脫落，導致凝集圖像不穩(wěn)定，容易消失，對照有可能不成立；而pH為7.0時紅細胞沉淀最充分，圖形最清晰，紅細胞對照成立，出現(xiàn)的結(jié)果易判讀。PBS盡可能現(xiàn)用現(xiàn)配，保存時間過長，pH會發(fā)生變化。采用生理鹽水做稀釋液時，生理鹽水應無菌、無雜質(zhì)，自制的生理鹽水pH值應保持在7.0，如有偏差，可用磷酸二氫鉀調(diào)節(jié)。鹽濃度亦不能過高，否則NaCl在一定濃度時會發(fā)生鹽類凝集現(xiàn)象。用PBS做稀釋液比生理鹽水測出的抗體效價要高，可提高檢出率。如果試驗結(jié)果要求嚴格，盡量不要使用生理鹽水，因為生理鹽水不具備酸堿緩沖能力。

1.3 1%紅細胞懸液

1.3.1 紅細胞的宿主來源 同種禽血清或卵黃抗體與不同種禽紅細胞之間會出現(xiàn)非特異性凝集，有時會掩蓋特異性抗體血凝抑制，導致試驗結(jié)果出現(xiàn)假陰性。如用雞紅細胞檢測水禽禽流感抗體時就可能會出現(xiàn)非特異性凝集現(xiàn)象，而用水禽紅細胞檢測同種水禽的禽流感血清抗體，則可以有效去除血清非特異性凝集的影響，且能更準確地反映疫苗接種后水禽體內(nèi)的抗體水平。因此，試驗中應盡可能選擇與宿主來源相同的紅細胞懸液檢測家禽抗體水平。

1.3.2 紅細胞的宿主要求 來源于不同個體的紅細胞對病毒的敏感程度會有所不同，有的個體紅細胞有自凝現(xiàn)象，從而影響HI效價，所以配制雞紅細胞最好選取2～4只健康、未經(jīng)過疫苗免疫的成年SPF公雞的混合紅細胞。條件不足的可選用無禽流感和新城疫等抗體的健康公雞。另外大型養(yǎng)雞場淘汰的健康公雞，在專用的飼養(yǎng)室飼養(yǎng)6個月左右，確保體內(nèi)的禽流感和新城疫等抗體水平降低后也可采用。如果用免疫公雞代替SPF公雞，在洗滌紅細胞時須增加洗滌次數(shù)和時間，否則將影響紅細胞的敏感性。

1.3.3 紅細胞的采集和制備 采血前先將注射器內(nèi)吸入3.8%枸櫞酸鈉（1份抗凝劑可抗凝4份血液）或阿氏液（抗凝劑和血液等體積）再翅下靜脈采血。采完后將注射器反復顛倒幾次以充分混勻，防止血液凝固。將所采雞血注入大離心管，加入PBS液或新鮮生理鹽水混勻，1500～2000r/min離心10min，重復洗滌3～5次，每次離心后用滅菌吸管吸棄掉上清液和白細胞層，保留紅細胞層。對于免疫狀況不明的雞全血，最少洗滌5次，以減少血液中抗體對試驗結(jié)果的影響。最后一次洗滌離心后，吸去上清液，沿管底部吸取一定量的紅細胞泥用稀釋液稀釋成1%的紅細胞懸液，置4℃可保存3～5d。

要控制好配制的紅細胞濃度，因為隨紅細胞濃度增加，血凝（HA）滴度下降，HI滴度有所上升，而且紅細胞的濃度越高，出現(xiàn)結(jié)果的時間越短。配好的紅細胞懸液要進行標定：取紅細胞懸液60ml，自然沉淀后，吸棄稀釋液50ml，混勻后裝入刻度離心管內(nèi)，以10000r/min離心5min，紅細胞壓積應為6%，否則應適當調(diào)整標定。紅細胞要做沉淀檢查：取96孔V型板一塊，滴一滴紅細胞懸液到任意孔內(nèi)，室溫靜置20～40min，查看血細胞沉淀情況，決定是否能用。要想長期保存可使用紅細胞醛化法：將離心處理好的紅細胞加入8倍量體積的冷至4℃的36%甲醛溶液混合均勻，置4℃作用24h，期間不斷輕搖震蕩；2000r/min離心10min，將紅細胞加入2倍量體積的冷至4℃的30%甲醛溶液混勻，4℃作用24h，離心后紅細胞用PBS液洗滌5次，最后配成0.75%醛化紅細胞液，加入終濃度0.1%疊氮納4℃?zhèn)溆谩?.75%醛化紅細胞懸液可完全替代1%新鮮紅細胞，并可保存紅細胞2個月以上。紅細胞的洗滌和貯存很關鍵，如果紅細胞沒有洗凈或保存不好，則會嚴重干擾試驗結(jié)果，出現(xiàn)紅細胞始終不沉淀或沉淀過快、部分凝集等。進行紅細胞懸液配制吸取沉淀的紅細胞時，要在離心管最底部吸取進行稀釋配制，如隨意從沉淀的紅細胞上層吸取將會導致配制的紅細胞懸液濃度偏低，因為最后一次離心洗滌紅細胞后棄去的PBS液會有一些殘留在沉淀的紅細胞上層。注意紅細胞在使用時一定要把沉積的紅細胞吹散，充分混合均勻。另外，不可使用破裂溶血的紅細胞進行試驗。

2 試驗前準備

2.1 V型微量反應板的選擇 用于血凝抑制試驗的微量血凝板一般分為一次性使用的聚苯乙烯塑料反應板和可重復使用的有機玻璃反應板（主要成分為聚甲基丙烯酸甲酯），每種又有96孔和72孔兩種規(guī)格，按孔型又可分為V型和U型兩種。V型具有更典型的凝集模型，U型有時比V型的血凝效價高1～2孔。有機反應板因清洗不凈和過度磨損會影響試驗結(jié)果，因此如果使用有機反應板的話，要注意清洗程序，一定要徹底清洗干凈，磨損嚴重的有機反應板要及時淘汰，而使用一次性塑料反應板能夠避免清洗不凈和過度磨損而影響試驗結(jié)果的問題。試驗建議使用一次性96孔V型優(yōu)質(zhì)塑料反應板。使用一次性凝集板，要求試驗前檢查凝集板，剔除有漏洞、形狀不規(guī)則、板面有褶皺、有接口、板面和板孔不干凈、不光滑的凝集板。根據(jù)不同試驗對反應板的要求進行選擇，口蹄疫血凝試驗要求110°V型反應板，而對新城疫、禽流感等的檢測，國標中則無特定要求。有研究證實，禽流感血凝抑制試驗中使用110°和90°兩種V型血凝板，其檢測結(jié)果無差異，可以任選一種進行試驗。使用不合格的反應板會嚴重影響結(jié)果。反應板整包開封后，若一次使用不完，應保持包裝完整，確保剩余反應板的清潔無磨損。

2.2 微量移液器、槍頭和離心管的選擇與準備 根據(jù)試驗需要選擇合適量程范圍的8道、12道或單道微量移液器及相匹配的槍頭，忌用大量程的移液器移取小體積樣品，否則會影響移液器的準確性，槍頭必須安裝牢固，防止漏氣和掉落。移液器吸取液體時遵循“緩吸快打”原則，使用時不要用力過猛，浸入液體深度要合適，不要過深，角度保持豎直為佳。移液前應先預濕槍頭，按一檔，停留片刻后緩慢平穩(wěn)地吸取液體，絕不能突然松開，以防溶液吸入過快而沖入移液器內(nèi)而產(chǎn)生氣泡。排出樣品時按二檔徹底排出槍頭內(nèi)的液體。必要時可采用反向移液法，二檔吸液，一檔排液，將殘余液體隨槍頭棄去，這種方法精確性更高。加樣完畢，把移液器的量程調(diào)至最大值的刻度，使彈簧處于松弛狀態(tài)，利于移液器的保養(yǎng)。使用一段時間后，要及時請微量移液器的生產(chǎn)廠家進行校正，避免產(chǎn)生錯誤或不精確的結(jié)果。

移液器盡量使用高質(zhì)量的、一次性的槍頭，經(jīng)高壓滅菌后備用。如果反復使用，在使用后應立即在消毒液中浸泡，然后經(jīng)超聲波清洗、高壓滅菌后方可反復使用，使用3～5次后要及時淘汰，及時更新。如果質(zhì)量不太好的話，在用多道移液器時一定要注意安裝上槍頭后管嘴能夠并齊。槍頭一定要與移液器上槍頭套管密封完好，防止由于空氣泄露而造成加樣精度或準確度的誤差。

離心管可選用1.5ml或2ml的一次性離心管，經(jīng)高壓滅菌后備用。

2.3 抗原和陽性血清的制備與貯存 抗原和陽性血清一般為凍干制品，應-20℃保存。在進行抗原效價的測定時，同一種抗原最好兩瓶以上混合后使用，并做重復試驗，取其平均值，減少誤差?？乖哪瘍r在外界不穩(wěn)定，冷藏保存或反復凍融時其效價降低，因此應盡量減少反復凍融次數(shù)。測定好效價的抗原如果一次不能用完時應分裝到滅菌離心管內(nèi)，管上標注分裝日期和效價，每管的分裝量最好是一次使用量，避免反復凍融。每次試驗前必須檢測抗原的血凝價，以確定4單位抗原的配制。如果發(fā)現(xiàn)抗原效價過低則不能使用。

3 樣品的采集和處理

3.1 雞蛋的選擇 如果檢測禽群疫苗免疫后的的卵黃抗體水平，應隨機抽取一定數(shù)量的各個禽群所產(chǎn)禽蛋，兼顧異常蛋與正常蛋。如果用于禽群疾病的檢測，可選擇異常蛋（白皮、軟皮、畸形蛋，恢復期產(chǎn)的小蛋，瀕死或死亡雞剖檢的變形卵泡）進行抗體檢測。

3.2 卵黃抗體的提取 由于卵黃萃取方法比直接卵黃稀釋所得檢測結(jié)果更直觀、準確且易于判斷，因此建議采用氯仿萃取法提取禽蛋卵黃抗體。將收集的禽蛋應用75%酒精消毒蛋殼后，打開蛋殼棄去蛋清，用1ml注射器（去掉針頭）或者1ml槍頭（適當減掉頭部少許）插入蛋黃內(nèi)部吸取0.4ml蛋黃，置入預先準備好的裝有0.4ml PBS的2ml離心管并充分混勻，混合后每管加入0.8ml氯仿，置振蕩器充分混勻后室溫靜置1h，然后4000r/min離心10min，溶液分為3層，吸取上清液備用或置4℃保存（氯仿體積不計，待檢樣品按被稀釋2倍計算）。

4 4個血凝單位（HAU）抗原的制備與貯存

4.1 血凝試驗 配制4HAU抗原前需先對抗原做血凝試驗，以抗原與紅細胞完全凝集的最高稀釋孔作為抗原效價。應按照國標進行HA試驗操作。先在96孔微量板每排1～12孔內(nèi)加25μl，每種抗原至少加3排，然后在每排第1孔加入25μl準備好的抗原液，棄掉槍頭后，換新槍頭進行1～11孔的倍比稀釋，第11孔稀釋完后吸取25μl棄掉，第12孔為細胞對照。為確保配置好的4HAU與HI試驗結(jié)果吻合，需每孔補加25μl稀釋液，然后再加入充分混勻的25μl 1%的紅細胞懸液，確保每孔總體積與HI試驗相一致為75μl。置振蕩器震蕩，室溫靜置20～30min或2～8℃ 40min后觀察結(jié)果。有時候抗原效價較高，測定4單位抗原時第11孔顯示完全血凝，出現(xiàn)這種情況時，不能斷定抗原血凝單位，根據(jù)經(jīng)驗應該將抗原倍比稀釋度繼續(xù)多稀釋2～3個孔，以出現(xiàn)完全凝集的最高稀釋倍數(shù)代表1個血凝單位，從而獲得4單位抗原效價。

4.2 4HAU抗原的配制與貯存 根據(jù)血凝試驗結(jié)果，將其除以4作為抗原稀釋倍數(shù)，配制4HAU抗原并充分混勻。為防止4單位抗原配制不準確，在HI試驗前必須做抗原回滴驗證，方法同HA試驗，要求稀釋的第1孔、第2孔的紅細胞完全凝集，而第3孔、第4孔部分凝集（紅細胞在孔壁凝成一紅圈而不是均勻的凝集）或不凝集，即第2孔為完全凝集的終點，則說明配制的4單位抗原沒有問題，可以使用。也可先在微量反應板的1～4孔分別加入稀釋液25、50、75、100μl，然后在每孔各加入4單位抗原25μl并充分混勻。另取1排反應孔，第1孔加入4單位抗原液25μl，第2～5孔分別加入上述稀釋好的1～4孔內(nèi)的抗原液各25μl，6～7孔分別加入25μl稀釋液作紅細胞對照，最后吸取1%紅細胞懸液25μl依次加入1～7孔中，置振蕩器震蕩，室溫靜置20～30min或2～8℃ 40min后觀察結(jié)果。若第1、2、3孔完全凝集，第4、5孔不完全凝集，第6～7孔完全沉淀，則表明配制的4單位抗原準確，否則需重新測定抗原效價。重新配制4個HAU抗原并做回歸試驗，直至結(jié)果準確。4個HAU抗原要現(xiàn)用現(xiàn)配，混懸液要混勻，不能長時間存放，也不可反復凍融。配好的抗原室溫下放置不要超過4h，特別是在夏天氣溫高時，抗原容易失效。如檢驗樣品過多，4單位抗原添加時間較長最好放在冰上進行操作，以免抗原失效。4單位抗原即工作抗原的準確制備是HI試驗過程中的重要環(huán)節(jié)，在HI試驗中至關重要，抗原效價測定不準確對試驗結(jié)果影響很大。過高，測定的抗體效價降低；過低，測定的抗體效價升高。為了得到準確的抗原效價，建議試驗中同時進行多排測定，取平均滴度作為抗原的最終效價。

5 血凝抑制試驗操作與結(jié)果判定

5.1 HI試驗 4單位抗原配制并驗證好后，可進行禽蛋卵黃抗體的HI檢測。取96孔微量反應板，按照需要現(xiàn)在每排第2～12孔各加入25μl稀釋液，然后在每排第1孔和第2孔各加入25μl被檢抽提好的卵黃抗體上清液，從每排第2孔開始倍比稀釋直到第10孔，第10孔稀釋完后吸取25μl棄掉，這樣稀釋的卵黃抗體濃度為10-1～10-10，第11孔作為抗原對照，第12孔作為稀釋液對照。另設1排1～11孔倍比稀釋的陽性血清對照。被檢禽蛋卵黃抗體樣品和對照陽性血清加完后，微量板每排1～11孔各加入25μl配置好并充分混勻的4單位抗原，最后一排加入25μl稀釋液，將微量板置震蕩器，充分震蕩1min后室溫放置20～30min。最后取反應板，每孔加入25μl配置好并充分混勻的1%紅細胞懸液，充分震蕩后室溫放置20～30min或2～8℃ 40min后，觀察結(jié)果并讀數(shù)。

5.2 結(jié)果判定 結(jié)果判定時，以完全抑制4單位抗原的卵黃抗體最高稀釋倍數(shù)作為HI效價。將微量反應板傾斜45°，孔底沉淀的紅細胞流動性好，呈淚滴樣流淌，邊緣無凝集顆粒者為凝集完全抑制。淚滴長度可參照稀釋液對照孔，與稀釋液對照孔淚滴長度相同的孔為完全抑制孔。如果淚滴樣流淌線較細，可能是反應時間不夠，需靜置一段時間再判讀。淚滴長度會隨時間變化，所以判斷時應迅速。在判定結(jié)果時，首先要觀察對照是否成立。HI試驗對照成立的條件是：陽性血清對照孔誤差不超過1個滴度，4單位抗原對照完全凝集，稀釋液對照完全不凝集。只有在對照成立的條件下試驗結(jié)果才有效，否則需要重檢。卵黃抗體樣品HI效價小于或是等于3log2判定HI試驗陰性；等于4log2為可疑，需重復試驗；大于或等于5log2為陽性。讀結(jié)果的具體時間要根據(jù)實際情況而定，不要一味的按照國標所規(guī)定的時間來，溫度對實驗結(jié)果的顯示有一定的影響，在等待結(jié)果時不要頻繁的翻動反應板。讀結(jié)果時不宜時間過長，否則將影響結(jié)果的顯示與判定。環(huán)境溫度對結(jié)果的出現(xiàn)影響很大。溫度過低，出現(xiàn)結(jié)果要慢；環(huán)境溫度過高，超過30℃時，試驗結(jié)果出現(xiàn)得要快，一旦時間過長，結(jié)果就會消失，使整板無凝集現(xiàn)象。另外，不要將反應板放置于風扇、空調(diào)或風機出風口，以免液體揮發(fā)較快，影響試驗結(jié)果。

6 小結(jié)

綜上所述，在血凝抑制試驗中，影響試驗結(jié)果的因素很多，只有嚴格遵守各項操作規(guī)程，耐心細致地做好每一個環(huán)節(jié)，同時綜合考慮各方面的因素，發(fā)現(xiàn)問題及時糾正處理，才能保證試驗結(jié)果的準確，從而準確評價雞群免疫的效果。