馮民賢 賴春華

摘要 [目的]建立柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定植物油中黃曲霉毒素B₁含量的方法。[方法]樣品甲醇水溶液（45+55）、三氯甲烷提取濃縮之后，用苯乙腈（2+98）溶解，三氟乙酸衍生，反相C18柱分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，所用激發(fā)及發(fā)射波長(zhǎng)依次為365、440 nm。[結(jié)果]試驗(yàn)表明，黃曲霉毒素B₁線性關(guān)系良好，對(duì)添加黃曲霉毒素B₁的樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率在89.5%，重復(fù)性試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為2.34%。[結(jié)論]該法操作簡(jiǎn)單、線性范圍廣、效果良好，可用于測(cè)定植物油中黃曲霉毒素B₁的含量。

關(guān)鍵詞 黃曲霉毒素B₁；高效液相色譜；柱前衍生；植物油

中圖分類(lèi)號(hào) S609.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）26-09180-01

Determination of Aflatoxin B₁in Vegetable Oil by HPLC with Pre-column Derivatization

FENG Min-xian et al （Liuzhou Product Quality Supervision and Inspection Institute， Liuzhou， Guangxi 545006）

Abstract [Objective] To establish the method for determining aflatoxin B₁in vegetable oil by pre-column derivatization with HPLC. [Method] Aqueous methanol （45+55） and chloroform after extraction and concentration， were dissolved in benzene acetonitrile （2+98）， derived from trifluoroacetic acid， separated by reversed phase C18 column and detected by fluorescence detector， excitation and emission wavelengths were 365 and 440 nm. [Result] The results showed that aflatoxin B₁has a good linear relationship， spiked recovery test was conducted on samples with aflatoxin B₁， recovery rate was 89.5%， repeatability relative standard deviation （n=6） is 2.34%. [Conclusion] The method is simple， and has wide linear range and good effect， which can be used for determination of aflatoxin B1 in vegetable oil.

Key words Aflatoxin B₁； HPLC； Pre-column derivatization； Vegetable oil

黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生蟲(chóng)產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類(lèi)似的代謝產(chǎn)物，具有極強(qiáng)的毒性，被世界衛(wèi)生組織定為1類(lèi)致癌物質(zhì)^[1]。黃曲霉毒素廣泛存在于糧油制品中，尤其以黃曲霉毒素B₁為多。為了控制食品中黃曲霉毒素的含量，目前世界各國(guó)都規(guī)定了其在植物油中的最大限量，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2761-2011規(guī)定了花生油黃曲霉毒素 B₁的含量不大于20 μg/kg，其他植物油為10～20 μg/kg。

目前國(guó)際上測(cè)定黃曲霉毒素B₁常見(jiàn)的方法有薄層層析法（TLC）^[2]、酶聯(lián)免疫分析法（ELIAS）^[3]、高效液相色譜法配柱后衍生系統(tǒng)^[4]。薄層層析法，其步驟多，測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，干擾因素多，試劑耗費(fèi)大，靈敏度低，熒光強(qiáng)度的目測(cè)精確性較差，特異性不強(qiáng)且安全性較差，主要用于半定量測(cè)定。酶聯(lián)免疫分析法其靈敏度高，特異性強(qiáng)，分析速度較快，其缺點(diǎn)主要在于影響因素較多，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性造成誤判。高效液相色譜法分離能力強(qiáng)，靈敏度高，特異性好，其檢測(cè)結(jié)果可靠。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用TLC和HPLC（配柱后衍生系統(tǒng)）測(cè)定植物油黃曲霉毒素B₁的含量，TLC中采用紫外點(diǎn)樣分析方法，在熒光檢測(cè)下觀察藍(lán)色的熒光點(diǎn)，此法檢出限高，且偏差較大。因此，建立一種快速檢測(cè)植物油中黃曲霉毒素B₁的方法是十分必要的。

1 材料與方法

1.1 材料 供試6種植物油分別為大豆油1、大豆油2、花生調(diào)和油1、花生油1、花生調(diào)和油2、花生油2。島津LC-20AT高效液相色譜儀，配有熒光檢測(cè)器，氮吹儀，恒溫培養(yǎng)箱，漩渦混合器。主要試劑：黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)品（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心），甲醇（色譜級(jí)），乙腈（色譜級(jí)），三氟乙酸（分析純），水（三級(jí)用水），石油醚（分析純），三氯甲烷（分析純）。

1.2 方法

1.2.1 提取。稱(chēng)取10 g（0.01 kg）樣品、加30 ml石油醚（60～90 ℃沸程）溶解，轉(zhuǎn)入分液漏斗中，加30 ml甲醇水（45+55）分?jǐn)?shù)次洗滌燒杯，一并倒入分液漏斗中，搖勻，靜置數(shù)分鐘；把下層液體轉(zhuǎn)入另一個(gè)分液漏斗中，加30 ml三氯甲烷，搖勻，靜置分層，收集下層溶液，揮發(fā)近干，加1.5 ml苯-乙腈溶解定容，待衍生。

1.2.2 衍生。取上述溶液200 μl加200 μl三氟乙酸衍生，漩渦后，放入50 ℃恒溫干燥箱中衍生5 min，氮吹儀吹干，用流動(dòng)相定容1 ml，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，待上機(jī)。

1.2.3 色譜條件。色譜柱：C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈水（13+75）∶甲醇=75∶25；檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)365 mm，發(fā)射波長(zhǎng)440 mm；進(jìn)樣量10 μl；流速1.0 ml/min。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1 μg/ml，體積1 ml，用苯乙腈定容至5 ml，得0.2 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)使用液。分別取50、100、200、400、800 μl衍生，氮吹儀吹干，定容1 ml，得進(jìn)樣濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 μg/ml。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

在研究選用不同比例的流動(dòng)相，采用NY/T1286-2007標(biāo)準(zhǔn)第8.3.2條為甲醇∶水∶乙腈=13∶75∶12，色譜峰在18 min出峰，且峰形寬大、不對(duì)稱(chēng)。經(jīng)多次研究發(fā)現(xiàn)，采用乙腈水比例固定，甲醇比例高，能縮短出峰時(shí)間，且色譜峰形尖銳、對(duì)稱(chēng)，圖1～3為標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖。由圖1、3可看出，甲醇∶（乙腈+水）比例為20∶（78+12）時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在9.6 min出峰。

2.2 衍生方式的選擇

由于黃曲霉毒素B₁具有熒光強(qiáng)度特性，在TLC方法中濃度較高的標(biāo)準(zhǔn)品具有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，可以在紫外點(diǎn)樣分析儀看出，微弱的熒光強(qiáng)度則無(wú)法判斷且容易被雜質(zhì)造成干擾。但可以用液相色譜儀檢出，需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生，用于加強(qiáng)黃曲霉毒素B₁的熒光強(qiáng)度。目前衍生的方法有柱前衍生和柱后衍生，柱前衍生法主要有三氟乙酸衍生法和鹽酸衍生法。該試驗(yàn)中采用的是柱前衍生方法，對(duì)衍生劑的用量，衍生時(shí)間、衍生溫度做了考察，結(jié)果在衍生劑200 μl，50 ℃，衍生5 min條件下，可取得較好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取植物油樣品1（大豆油1），分別按照“1.2”

試驗(yàn)方法進(jìn)行提取衍生，再進(jìn)行液相色譜分析。對(duì)黃曲霉毒素B₁峰面積的重現(xiàn)性進(jìn)行分析，結(jié)果峰面積的RSD（n=6）為2.34%，表明該方法的重復(fù)性較好。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，在相同色譜條件下分析其峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為1.38%，表明該方法的精密度良好。

2.5 回收率試驗(yàn) 對(duì)未檢出的植物油加入標(biāo)準(zhǔn)品后，測(cè)定黃曲霉毒素B₁含量并計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6 6種植物油中黃曲霉毒素B₁含量的檢測(cè) 供試6種植物油經(jīng)提取、濃縮、衍生之后，檢測(cè)結(jié)果如下：大豆油1、大豆油2、花生調(diào)和油1、花生油1、花生調(diào)和油2、花生油2中的黃曲霉毒素B₁含量依次為0.02、0.34、1.46、5.49、2.34、4.89 μg/kg。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)建立了一種測(cè)定植物油中黃曲霉毒素B₁的分析方法，樣品經(jīng)提取、濃縮、衍生，結(jié)果可靠，干擾因素小，減少了薄層層析法中用肉眼來(lái)判斷而帶來(lái)的誤差，方法準(zhǔn)確度較高、專(zhuān)屬性較強(qiáng)，可為植物油中黃曲霉毒素的監(jiān)管提供技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)

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