劉建博 鄭雪 宋百軍 李榮權(quán) 康偉 馬麗娟

摘要 [目的] 探索不同飼養(yǎng)模式對雜交鹿血清中MBL抗菌活性的影響。[方法] 采用平板計(jì)數(shù)法研究雙陽梅花鹿和清原馬鹿雜交F1代MBL的抗菌活性，探討MBL作為補(bǔ)體功能候選蛋白的可行性，分析MBL抗化膿感染創(chuàng)傷致病菌的活性。[結(jié)果] 放養(yǎng)模式試驗(yàn)組抗金黃色葡萄球菌活性和抗大腸桿菌活性都顯著高于圈養(yǎng)模式試驗(yàn)組、D-甘露糖試驗(yàn)組和N-乙酰基-D-葡萄糖胺試驗(yàn)組（P<0.05）。放養(yǎng)模式試驗(yàn)組抗金黃色葡萄球菌活性和抗大腸桿菌活性對動(dòng)物機(jī)體的保護(hù)作用具有顯著的生物學(xué)意義。[結(jié)論]該研究可為雜交一代肉用鹿的抗病高產(chǎn)育種工作提供一定的理論依據(jù)和基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞 飼養(yǎng)模式；雜交鹿；MBL；抗菌活性

中圖分類號 S825 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號 0517-6611（2014）26-09038-02

Effect of Different Feeding Modes on Serum of MBL Antibacterial Activity in Hybrid Deer

LIU Jian-bo，MA Li-juan et al

（Jilin Agricultural Science and Technology College， Jilin， Jilin 132101； Key Laboratory of Changbai Mountain Animal and Plant Resources' Utilization and Protection of Universities in Jilin Province， Jilin， Jilin 132101）

Abstract [Objective] The research aimed to the effects of different feeding modes on the antibacterial activity of MBL in the serum of hybridized deer. [Method] The antibacterial activity of MBL in hybridized F1 generation of Shuangyang Deer and Qingyuan Wapiti was determined by using plate counting method. The feasibility of taking MBL as functional candidate protein of complement was discussed. The antibacterial activity of MBL against pathogens caused by pyogenic infection and wound was analyzed. [Result] The antibacterial activities of MBL to Staphylococcus aureus and Escherichia coli in grazing mode group were significantly higher than those in captive mode group， D-mannose group and N-acetyl -D-glucosamine group（P<0.05）. The antibacterial activities to S. aureus and E. coli in grazing model group were of significant biological meaning for protecting the animal bodies. [Conclusion] The research could provide theoretical basis and basic data for disease-resistant and high-yield breeding of hybridized meat deer.

Key words Feeding mode；Hybrid Deer；MBL；Antibacterial Activity

鹿屬于野生動(dòng)物，喜跑跳，尤其是幼齡鹿活動(dòng)強(qiáng)度和范圍更大，因而導(dǎo)致化膿感染創(chuàng)傷的幾率很大。由于鹿的化膿感染創(chuàng)傷治療難度大，增加養(yǎng)鹿成本，并且致病微生物、殘留毒素和藥物殘留會(huì)影響鹿肉品質(zhì)。雖然傳統(tǒng)的化膿感染創(chuàng)傷防治方法對創(chuàng)傷治療起到了一定作用，但很難控制化膿感染創(chuàng)傷的發(fā)生，同時(shí)也帶來了藥物殘留和耐藥菌株等問題。隨著免疫遺傳學(xué)的高速發(fā)展，從遺傳免疫角度尋找具有抗炎效應(yīng)的候選蛋白已成為抗病育種的熱點(diǎn)。補(bǔ)體系統(tǒng)的先天性免疫應(yīng)答功能對病原微生物有溶菌作用和調(diào)理作用，其免疫功能是通過特異性受體和分子間相互作用實(shí)現(xiàn)的^[1]。甘露糖結(jié)合凝集素（Mannan-binding lectin，MBL）是一種模式識(shí)別蛋白，由肝細(xì)胞分泌后進(jìn)入血液的，屬于C型膠原凝集素（鈣依賴型凝集素）^[2]。MBL具有免疫活性，可以直接識(shí)別粘合多種病原微生物，能夠通過凝集素途徑激活補(bǔ)體。此外，MBL具有調(diào)理、中和及補(bǔ)體激活的功能，其抗菌作用高度依賴低聚體的聚集程度和糖識(shí)別域的成簇方向，并且糖識(shí)別域能效仿病原體表面結(jié)構(gòu)而識(shí)別病原微生物^[2-5]。目前，尚未見到關(guān)于鹿MBL的相關(guān)報(bào)道?；诖?，筆者采用平板計(jì)數(shù)法研究雙陽梅花鹿和清原馬鹿雜交一代肉用鹿MBL的抗菌活性，探討牛MBL作為補(bǔ)體功能候選蛋白的可行性，分析MBL抗化膿感染創(chuàng)傷致病菌的活性，旨在為雜交一代肉用鹿的抗病高產(chǎn)育種工作提供一定的理論依據(jù)和基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清。

選擇圈養(yǎng)模式（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院提供）和放養(yǎng)模式（吉林省九臺(tái)市安錫山鹿苑提供）12月齡的雙陽梅花鹿和清原馬鹿雜交一代鹿各10頭，采用長桿吹針方式對鹿進(jìn)行麻醉，臀部肌注鹿眠寶3號（1.5～2.0 ml/頭），完全麻醉后頸靜脈采血5 ml，3 000 r/min離心15 min分離血清，-20 ℃條件下保存待測。采血后，每頭試驗(yàn)鹿注射鹿醒寶1.5～2.0 ml催醒（靜脈和肌肉注射各半）。

1.1.2 細(xì)菌。

由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供大腸桿菌（革蘭氏陰性菌，E.coli ATCC35218）和金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌，S.aureus ATCC29213）。

1.1.3 MBL特異性抑制劑。N-乙?；?D-葡萄糖胺和D-甘露糖。

1.1.4 綿羊血?？鼓摾w維綿羊血-用于制作血瓊脂平板。

1.2 方法

1.2.1 分組。先按菌種分成不同處理，分為金黃色葡萄球菌處理（革蘭氏陽性菌）和大腸桿菌處理（革蘭氏陰性菌），每個(gè)處理又分為：①放養(yǎng)模式試驗(yàn)組：放養(yǎng)模式飼養(yǎng)的12月齡F1代鹿個(gè)體血清10個(gè)；②圈養(yǎng)模式試驗(yàn)組：圈養(yǎng)模式飼養(yǎng)的12月齡F1代鹿個(gè)體血清10個(gè)；

③D-甘露糖試驗(yàn)組：樣本為放牧模式飼養(yǎng)的12月齡F1代鹿個(gè)體血清10個(gè)；④N-乙?；?D-葡萄糖胺試驗(yàn)組：樣本為放牧模式飼養(yǎng)的12月齡F1代鹿個(gè)體血清10個(gè)。

1.2.2 抗菌活性的測定。

將金黃色葡萄球菌懸浮液和大腸桿菌懸浮液（106 CFU/ml PBS）分別與放養(yǎng)模式試驗(yàn)組、圈養(yǎng)模式試驗(yàn)組、D-甘露糖試驗(yàn)組和N-乙?；?D-葡萄糖胺試驗(yàn)組的鹿血清混合（200 μl，1∶1）置于高壓滅菌過的EP管中，其中D-甘露糖試驗(yàn)組和N-乙?；?D-葡萄糖胺試驗(yàn)組的鹿血清分別先與25 mmol/L D-甘露糖和50 mmol/L N-乙?；?D-葡萄糖胺在5% CO₂和37 ℃的條件下反應(yīng)30 min后再與菌液混合；將密封后的EP管置于37 ℃和5% CO₂的培養(yǎng)箱中反應(yīng)24 h；再將每個(gè)完成反應(yīng)的樣本用PBS稀釋105倍后均勻涂于平板上（大腸桿菌涂LB瓊脂平板，金葡菌組涂血瓊脂平板），每個(gè)樣本重復(fù)3次；同樣，將每個(gè)血平板置于37 ℃、5% CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h（30 min后將平板倒置）；最后，采用平板計(jì)數(shù)法對每個(gè)平板的CFU計(jì)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 17.0的一維方差分析程序按金黃色葡萄球菌組和大腸桿菌組對試驗(yàn)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

從圖1可以看出，放養(yǎng)模式試驗(yàn)組的抗金黃色葡萄球菌活性和抗大腸桿菌活性都顯著高于圈養(yǎng)模式試驗(yàn)組、D-甘露糖試驗(yàn)組和N-乙酰基-D-葡萄糖胺試驗(yàn)組（P<0.05）。試驗(yàn)表明，放養(yǎng)模式試驗(yàn)組的抗金黃色葡萄球菌活性和抗大腸桿菌活性對動(dòng)物機(jī)體的保護(hù)作用具有顯著的生物學(xué)意義；圈養(yǎng)模式試驗(yàn)組則是有患病傾向的。

3 討論

鹿化膿感染創(chuàng)傷主要是由微生物病原菌感染所致，特別是金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，約占鹿化膿感染創(chuàng)傷比例的74%^[6]。這些病原菌主要是由于挫傷嚴(yán)重、創(chuàng)內(nèi)搓滅組織和血塊較多、塵土、異物將細(xì)菌帶入或因?qū)π迈r污染創(chuàng)治療不及時(shí)、處理不當(dāng)而造成的^[7]。

人MBL與真菌^[8]、病毒^[8-11]和細(xì)菌^[12-13]的感染幾率相關(guān)，動(dòng)物機(jī)體易感染重癥肺炎和系統(tǒng)傳染病等疾病在很大程度上是由于凝集素變化引起的^[14]。小鼠MBL與抗金黃色葡萄球菌活性顯著相關(guān)^[15]，豬MBL與豬抵抗豬鏈球菌和豬環(huán)狀病毒能力顯著相關(guān)^[16]，水牛對布氏桿菌的抗性與MBL顯著相關(guān)^[17-19]。這說明不同的補(bǔ)體成分與動(dòng)物機(jī)體對細(xì)菌、病毒和寄生蟲的抵抗力顯著相關(guān)。Lillie等^[20]和Brooks等^[21]研究表明豬MBL有粘合細(xì)菌的功能。劉建博等研究表明MBL與奶牛對乳腺炎抗性相關(guān)^[22-23]。

綜上所述，鹿MBL具有抗菌功能，放養(yǎng)模式個(gè)體對創(chuàng)傷致病菌具有顯著抗性，而圈養(yǎng)模式個(gè)體為易感者，所以放養(yǎng)模式對鹿的健康有益，建議雜交肉用鹿采取圍欄放養(yǎng)模式進(jìn)行飼養(yǎng)。

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