修爽 祖國(guó)仁

摘要[目的]優(yōu)化海洋細(xì)菌Vibrio agarivorans1產(chǎn)瓊膠酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組分。[方法]首先通過單因素試驗(yàn)篩選出3個(gè)重要因子（瓊脂、NaCl和酵母膏質(zhì)量濃度），在單因素的基礎(chǔ)上，通過BoxBehnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法確定了3個(gè)因子的最優(yōu)發(fā)酵條件。[結(jié)果]最佳營(yíng)養(yǎng)組分為：瓊脂粉質(zhì)量濃度為3.9 g/L，NaCl質(zhì)量濃度為45.2 g/L，酵母膏質(zhì)量濃度為12.9 g/L，此條件下酶活力達(dá)到7.589 U/g，比優(yōu)化前提高了3.35倍。[結(jié)論]該研究對(duì)提高海洋細(xì)菌Vibrio agarivorans1產(chǎn)瓊膠酶具有重要意義。

關(guān)鍵詞海洋細(xì)菌Vibrio agarivorans1；瓊膠酶；響應(yīng)面

中圖分類號(hào)S188；TS201.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）23-07729-03

作者簡(jiǎn)介修爽（1989- ），女，遼寧鞍山人，碩士研究生，研究方向：海洋微生物。

收稿日期20140710瓊膠酶能將瓊膠多糖降解為瓊膠寡糖，目前瓊膠寡糖已廣泛應(yīng)用于食品業(yè)、化妝業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)，如作為抗氧化劑、功能性食品基料、天然防腐劑、淀粉老化抑制劑及高甜度甜味劑的填充劑和分散劑[1-3]等。同時(shí)瓊膠酶也是分解海藻獲得單細(xì)胞或原生質(zhì)體及推測(cè)其多糖結(jié)構(gòu)的一種重要工具酶[4]。利用瓊膠酶降解瓊膠是制備低聚糖的一個(gè)重要途徑，由于其具有專一性，可選擇性地酶切特定鏈的特定位置，且反應(yīng)條件溫和，降解流程易于控制，屬于綠色環(huán)保的技術(shù)，這有利于寡糖的規(guī)?；苽?，使酶解法在多糖降解中的應(yīng)用日益增加。

ENOKI等[5]認(rèn)為瓊膠寡糖具有誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡、抑制NO等作用。另有研究發(fā)現(xiàn)瓊膠寡糖具抗氧化[6-7] 、促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)、清除自由基等多種生理功能[8-9] 。

筆者通過單因素試驗(yàn)，確定對(duì)酶活影響較顯著的因素并選出不同因素的最優(yōu)條件，最后利用響應(yīng)面法確定最優(yōu)培養(yǎng)基組分和酶活最優(yōu)值。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌種。海洋細(xì)菌Vibrio agarivorans1，大連工業(yè)大學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏（大連黑石礁附近海域的江籬中分離得到）。

1.1.2培養(yǎng)基。試管斜面培養(yǎng)基（2216培養(yǎng)基）：瓊脂粉20 g/L、蛋白胨 5 g/L、酵母膏1 g/L、磷酸鐵0.1 g/L、海水1 L，pH 7.2。

液體種子培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L、酵母膏10 g/L、CaCl2 0.5 g/L、NaCl 25 g/L、FePO4 1 g/L、K2HPO4 1 g/L、FeSO4 0.3 g/L，pH 7.2。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：瓊脂粉2 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母膏10 g/L、CaCl2 0.5 g/L、NaCl 25 g/L、FePO4 1g/L、K2HPO4 1 g/L、FeSO4 0.3 g/L，pH 7.2。

1.1.3儀器與試劑。儀器：ZPS250智能生化培養(yǎng)箱，黑龍江東拓儀器有限公司；HH恒溫水浴鍋，鞏義市英峪生化儀器廠；TGL16G高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；ZHWY2120C恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；722S可見分光光度計(jì)，上海分析儀器廠；瓊脂粉，北京博奧星生物技術(shù)責(zé)任有限公司。

1.2方法

1.2.1DNS配制。甲液：將6.9 g結(jié)晶苯酚溶于15.2 ml 10%NaOH溶液，蒸餾水稀釋至69 ml，在此溶液中加入6.9 g亞硫酸氫鈉。

乙液：將255 g酒石酸鉀鈉溶于300 ml 10%NaOH溶液中，再加入880 ml 1%的3，5-二硝基水楊酸溶液。

將甲乙2溶液混合即得黃色試劑，儲(chǔ)于棕色瓶中放置7～10 d后使用。在棕色瓶?jī)?nèi)保存1年有效[10]。

1.2.2 酶活力測(cè)定。分別取1 ml發(fā)酵液和1 ml含0.2%瓊脂的磷酸緩沖溶劑于試管內(nèi)，40 ℃恒溫水浴鍋加熱30 min，再加入2 ml DNS試劑后沸水浴5～10 min，取出后定容至25 ml，以8 000 r/min離心10 min后取上清液用可見分光光度計(jì)在540 nm處測(cè)OD值[11-14]。

酶活力定義：以1 ml酶液1 min產(chǎn)1 U/g還原糖定義為一個(gè)活力單位。

酶活計(jì)算公式：1 000nΔA/kt，式中，ΔA為還原糖吸光值，n為發(fā)酵液稀釋倍數(shù)，t為酶液的反應(yīng)時(shí)間（min），k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

1.2.3產(chǎn)酶方法。挑取1環(huán)菌苔至5 ml種子培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min，培養(yǎng)24 h后將5 ml種子加入45 ml產(chǎn)酶培養(yǎng)基中（裝于250 ml三角瓶中），28 ℃、150 r/min，培養(yǎng)一段時(shí)間后測(cè)定酶活。

1.2.4單因素試驗(yàn)。取一環(huán)菌株接入裝有5 ml液體種子液培養(yǎng)基的試管中，28 ℃、150 r/min，培養(yǎng)24 h，再將5 ml種子加入45 ml的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中（裝于250 ml三角瓶中），28 ℃、150 r/min，培養(yǎng)一段時(shí)間后測(cè)定酶活性，研究瓊脂粉質(zhì)量濃度、酵母膏質(zhì)量濃度、NaCl質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響。

1.2.5響應(yīng)面分析。以瓊膠酶活性作為響應(yīng)值，優(yōu)化過程為：①在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上篩選出對(duì)瓊膠酶產(chǎn)量影響顯著的因素進(jìn)行因素水平設(shè)計(jì)。②利用響應(yīng)面法Boxbehnken設(shè)計(jì)，最終確定最優(yōu)發(fā)酵條件，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)[15-16]。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1瓊脂粉質(zhì)量濃度對(duì)瓊膠酶酶活力的影響。在發(fā)酵培養(yǎng)基中，去掉原有瓊脂粉，分別加入1、2、3、4、5、6 g/L的瓊脂粉，在28 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)24 h。結(jié)果見。由可知，當(dāng)瓊脂粉質(zhì)量濃度為3 g/L時(shí)，酶活達(dá)到最高值5.84 U/g，因此最佳瓊脂粉質(zhì)量濃度為3 g/L。瓊脂是菌株產(chǎn)瓊膠的誘導(dǎo)物，也是培養(yǎng)基中重要碳源，因此瓊脂粉質(zhì)量濃度對(duì)酶活性影響較大。

瓊脂粉質(zhì)量濃度對(duì)瓊膠酶酶活力的影響2.1.2NaCl質(zhì)量濃度對(duì)瓊膠酶酶活力的影響。在瓊脂粉質(zhì)量濃度3 g/L的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，去掉原有NaCl，分別加入15、25、35、45、55、65 g/L的NaCl，在28 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)24 h。結(jié)果見。由可知，在NaCl質(zhì)量濃度為45 g/L時(shí)，瓊膠酶酶活力達(dá)到最高為6.58 U/g。因?yàn)閂ibrio agarivorans1為海洋細(xì)菌，因此NaCl的質(zhì)量濃度對(duì)其影響較顯著。當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度過低時(shí)微生物所需的鹽離子不足，不利于菌株產(chǎn)酶，質(zhì)量濃度過高反而抑制微生物生長(zhǎng)。

NaCl質(zhì)量濃度對(duì)瓊膠酶酶活力的影響2.1.3酵母膏質(zhì)量濃度對(duì)瓊膠酶酶活力的影響。在瓊脂粉質(zhì)量濃度3 g/L、NaCl質(zhì)量濃度45 g/L的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，去掉原有酵母膏，分別加入6、8、10、12、14、16 g/L的酵母膏，在28 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)24 h，結(jié)果見。由可知，當(dāng)酵母膏質(zhì)量濃度為12 g/L時(shí)酶活力達(dá)到最高值6.92 U/g。酵母膏為培養(yǎng)基中重要氮源，適量的氮源有利于微生物的生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量濃度太低不能滿足微生物生長(zhǎng)需要，過高也會(huì)抑制微生物生長(zhǎng)。

酵母高質(zhì)量濃度對(duì)瓊膠酶酶活力的影響2.2響應(yīng)面試驗(yàn)根據(jù)BoxBenhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[17]，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果選取瓊脂粉質(zhì)量濃度、酵母膏質(zhì)量濃度及NaCl質(zhì)量濃度3個(gè)顯著因素，響應(yīng)值Y為瓊膠酶酶活力，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法，因素和水平見。

以瓊膠酶酶活力為響應(yīng)值，菌株產(chǎn)瓊膠酶酶活性影響因素響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見。

通過Design Expert7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果見。從可以更直觀地反映因素的交互作用對(duì)酶活的影響，NaCl質(zhì)量濃度和酵母膏質(zhì)量濃度曲線較陡，說明其對(duì)酶活影響較顯著。

解得：X1=0.09 X2=0.02 X3=0.04，即菌株的最優(yōu)培養(yǎng)基組分為：瓊脂粉質(zhì)量濃度為3.9 g/L，NaCl質(zhì)量濃度為45.2 g/L，酵母膏質(zhì)量濃度為12.9 g/L，最高酶活為7.602 U/g。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，依據(jù)響應(yīng)面結(jié)果確定的最優(yōu)培養(yǎng)基組分進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的酶活為7.589 U/g，與模型預(yù)測(cè)值基本吻合。

3結(jié)論

利用響應(yīng)面法確定海洋細(xì)菌Vibrio agarivorans1最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組分為：瓊脂粉質(zhì)量濃度為3.9 g/L，NaCl質(zhì)量濃度為45.2 g/L，酵母膏質(zhì)量濃度為12.9 g/L，在此條件下進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的最高酶活為7.589 U/g，與響應(yīng)面預(yù)測(cè)結(jié)果基本吻合。在響應(yīng)面法確定的最佳培養(yǎng)基組分下，酶活力較優(yōu)化前的2.261 U/g提高了3.35倍。

42卷23期修 爽等響應(yīng)面法優(yōu)化瓊膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)

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