錢(qián)衛(wèi)東 寧肖肖 趙德志等

摘要[目的]提高多形漢遜酵母發(fā)酵生產(chǎn)D阿拉伯糖醇的產(chǎn)量。[方法]通過(guò)正交試驗(yàn)確定了用多形漢遜酵母DL1發(fā)酵生產(chǎn)D阿拉伯糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組分，進(jìn)而結(jié)合培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響，獲得運(yùn)用變溫策略提高多形漢遜酵母生產(chǎn)D阿拉伯糖醇的方法。[結(jié)果]最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：葡萄糖200 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉12 g/L，Triton X100 10 g/L，硫酸銨3.0 g/L，七水硫酸鎂2.5 g/L，磷酸二氫鉀2.5 g/L；多形漢遜酵母DL1的最適生長(zhǎng)溫度和D阿拉伯糖醇最適合成溫度分別為37 ℃和34 ℃；變溫調(diào)控發(fā)酵方法為：將發(fā)酵培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)24 h后，升溫到48 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再降溫至34 ℃繼續(xù)培養(yǎng)96 h得到發(fā)酵液。采用該方法發(fā)酵結(jié)束后D阿拉伯糖醇產(chǎn)量為114.92 g/L，比恒溫發(fā)酵（37 ℃、48 ℃、34 ℃）分別提高了30.25%、208.66%、20.93%。[結(jié)論]該方法可以提高多形漢遜酵母發(fā)酵生產(chǎn)D阿拉伯糖醇。

關(guān)鍵詞 D阿拉伯糖醇，多形漢遜酵母DL1，正交試驗(yàn)，變溫調(diào)控

中圖分類(lèi)號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）23-07726-03

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“利用超遠(yuǎn)緣遺傳轉(zhuǎn)化酵母技術(shù)解析龍膽苦苷生物合成關(guān)鍵酶基因”（31100040）；陜西省教育廳項(xiàng)目“利用酵母全合成抗癌藥物紫杉醇的研究（2013JK0727）”。

作者簡(jiǎn)介錢(qián)衛(wèi)東（1980-），男，安徽蕪湖人，講師，博士，從事功能性酵母開(kāi)發(fā)方面的研究。

收稿日期20140710D阿拉伯糖醇是一種五碳多元糖醇，在機(jī)體內(nèi)的代謝與胰島素?zé)o關(guān)，是一種重要的功能性食品基料[1]。目前的主要生產(chǎn)方法有提取法、化學(xué)合成法及生物法[2]。

生物法具有成本低，易于操作，節(jié)能環(huán)保等特點(diǎn)。發(fā)酵法生產(chǎn)D阿拉伯糖醇常用的菌株一般都是耐高滲酵母。耐高滲酵母在高滲環(huán)境中能夠代謝產(chǎn)生多元糖醇，保護(hù)高滲條件下的細(xì)胞[3]。目前用于生產(chǎn)D阿拉伯糖醇的主要菌株有漢遜酵母屬（Hansenula）[4]、畢赤酵母屬（Pichia）[5]、假絲酵母屬（Candida）[6]、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）[7]、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）[8]。宋衛(wèi)斌[9]從花粉中篩選獲得了1株D阿拉伯糖醇產(chǎn)量為86.55 g/L的高產(chǎn)菌株，分析鑒定屬于假絲酵母屬。唐曉芳等[10]對(duì)Hansenula anomala轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)D阿拉伯糖醇的反應(yīng)條件進(jìn)行了研究，在最佳工藝條件下D阿拉伯糖醇濃度為245.97 g/L，轉(zhuǎn)化率為0.49 g阿拉伯糖醇/g葡萄糖。李澤[11]從高滲環(huán)境中篩選出1株D阿拉伯糖醇的高產(chǎn)菌株，并對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，在最佳工藝條件下進(jìn)行發(fā)酵，D阿拉伯醇的產(chǎn)量能達(dá)到60.6 g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為 26.11%。蔡利等[12]從高糖環(huán)境中篩選出一株D阿拉伯糖醇產(chǎn)量為54.65 g/L的高產(chǎn)菌株，命名為Kodamaea ohmeri NH9。尤翠萍等[13]研究了表面活性劑對(duì)得巴利漢遜酵母發(fā)酵生產(chǎn)D阿拉伯糖醇的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Triton X-100對(duì)D阿拉伯糖醇的生產(chǎn)具有顯著的促進(jìn)作用。

漢遜酵母屬中的多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha）是當(dāng)前國(guó)際公認(rèn)的理想細(xì)胞工廠之一[14]。多形漢遜酵母DL1是一種耐熱酵母（可在49 ℃條件下正常生長(zhǎng)），培養(yǎng)溫度較高，細(xì)胞生長(zhǎng)代謝速度較快，相對(duì)較高的培養(yǎng)溫度有利于降低冷卻成本和大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)的污染可能性。多形漢遜酵母可以在廉價(jià)的非選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，易于高密度發(fā)酵，具有廣泛的研究?jī)r(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種。多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha，H.polymorpha）DL1（ATCC No.26012）菌株，由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所邱并生研究員惠贈(zèng)；陜西科技大學(xué)制藥工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基。 斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂15 g/L，pH 6.0。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 ，pH 6.0。

高滲固體培養(yǎng)基：葡萄糖500 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂15 g/L，pH 6.0。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法。

1.2.1.1菌株預(yù)培養(yǎng)。 將斜面保藏的種子在37 ℃活化3 h后，挑取一個(gè)單菌落接種至裝有5 ml種子培養(yǎng)基的試管，37 ℃、160 r/min，振蕩培養(yǎng)24 h得種子液。將培養(yǎng)好的種子液涂布于葡萄糖含量為500 g/L的高滲固體培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h；挑取生長(zhǎng)較好的單菌落接種至種子培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)，37 ℃、160 r/min，振蕩培養(yǎng)24 h得種子液。重復(fù)此步驟馴化3次后，挑選生長(zhǎng)較大的單菌落涂布在高滲固體斜面保藏。

1.2.1.2種子培養(yǎng)。 將馴化后的種子在37 ℃活化3 h后，挑取一個(gè)單菌落接種至裝有100 ml種子培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，37 ℃、160 r/min，振蕩培養(yǎng)24 h得種子液。

1.2.1.3發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化。以葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、Triton X100、硫酸銨、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀的添加量為考察因素，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)置不同水平，運(yùn)用正交試驗(yàn)確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方。在溫度37 ℃、接種菌齡24 h、接種量5%、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min、發(fā)酵時(shí)間144 h的條件下，進(jìn)行7因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，具體設(shè)計(jì)見(jiàn)。發(fā)酵結(jié)果經(jīng)極差和方差分析，找出各培養(yǎng)基成分的最佳濃度。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)g/L

水平因素葡萄糖（A）蛋白胨（B） 酵母浸粉（C） Triton X-100（D） 硫酸銨（E）七水硫酸鎂（F）磷酸二氫鉀（G）115018863.02.52.522002010103.53.03.032502212144.03.53.5

1.2.1.4 變溫發(fā)酵培養(yǎng)。 將發(fā)酵培養(yǎng)基在37 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h后，升溫到48 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再降溫到34 ℃繼續(xù)培養(yǎng)96 h得發(fā)酵液，每隔24 h取樣分析。每組試驗(yàn)設(shè)計(jì)3組平行對(duì)照，取試驗(yàn)結(jié)果的平均值。

1.2.2 分析測(cè)定方法。

1.2.2.1 細(xì)胞干重測(cè)定。 將10 ml發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min后用蒸餾水洗滌2次得到的細(xì)胞在80 ℃下烘至恒重，稱重。

1.2.2.2 D阿拉伯糖醇產(chǎn)量和葡萄糖殘留量的測(cè)定。 取新鮮發(fā)酵液50 ml，8 000 r/min離心10 min，取上清，用微孔濾膜過(guò)濾。檢測(cè)條件：色譜柱SH1011；柱溫50 ℃；進(jìn)樣量5 μl；流動(dòng)相0.01 mol/L H2SO4；流速0.8 ml/ min；示差檢測(cè)器，根據(jù)保留時(shí)間分析D阿拉伯糖醇產(chǎn)物和葡萄糖底物的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化分析結(jié)果見(jiàn)和3。由可知，各因素的極差順序?yàn)镽A>RD>RB>RF>RC>RG>RE，極差R值越大，其對(duì)D阿拉伯糖醇產(chǎn)率影響越大。因此，影響因子的先后順序?yàn)椋浩咸烟?Triton X100>蛋白胨>七水硫酸鎂> 酵母浸粉>磷酸二氫鉀>硫酸銨。方差分析結(jié)果進(jìn)一步表明，A（葡萄糖）和D（Triton X100）對(duì)D阿拉伯糖醇的產(chǎn)率有顯著影響。用多形漢遜酵母DL1發(fā)酵生產(chǎn)D阿拉伯糖醇的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為A2B2C3D2E1F1G1，即葡萄糖200 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉12 g/L，聚乙二醇辛基苯基醚10 g/L，硫酸銨3.0 g/L，七水硫酸鎂2.5 g/L，磷酸二氫鉀2.5 g/L；依照此發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)，D阿拉伯糖醇產(chǎn)率可達(dá)91.46 g/L。

2.2溫度對(duì)D阿拉伯糖醇產(chǎn)量的影響

2.2.1 恒溫發(fā)酵。溫度是影響微生物細(xì)胞生長(zhǎng)以及代謝產(chǎn)物合成的一個(gè)重要因素。在發(fā)酵前期，溫度通過(guò)影響培養(yǎng)基的性質(zhì)進(jìn)而影響微生物菌體自身的生長(zhǎng)；在發(fā)酵中后期，溫度通過(guò)影響目標(biāo)產(chǎn)物生物合成關(guān)鍵酶的活性進(jìn)而調(diào)控代謝產(chǎn)物的合成。因此在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，必須保證合適的溫度。多形漢遜酵母DL1的最適生長(zhǎng)溫度是37～43 ℃，最高生長(zhǎng)溫度可達(dá)49 ℃。設(shè)置不同溫度（30、34、37、40、44、48 ℃）條件下恒溫發(fā)酵144 h，每隔8 h取樣測(cè)定菌體生物量及D阿拉伯糖醇產(chǎn)量，以期獲得該菌最適的發(fā)酵溫度，結(jié)果見(jiàn)。

正交試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)

從可以看出，溫度對(duì)菌體生物量及D阿拉伯糖醇含量有明顯的影響。由a可知，培養(yǎng)溫度為37 ℃時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速率顯著增大，40 h菌體開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)胞干重（DCW）達(dá)到最大值（5.32 g/L）；當(dāng)培養(yǎng)溫度為48 ℃時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，延滯期較長(zhǎng)。由b可知，培養(yǎng)溫度為34 ℃時(shí)，D阿拉伯糖醇生成速率最大，發(fā)酵結(jié)束后D阿拉伯糖醇總量達(dá)到95.03 g/L。

溫度對(duì)菌體生物量和D阿拉伯糖醇產(chǎn)量的影響2.2.2 變溫發(fā)酵。 從上述試驗(yàn)可以看出，多形漢遜酵母DL1發(fā)酵生產(chǎn)D阿拉伯糖醇過(guò)程中，菌體生長(zhǎng)和D阿拉伯糖醇生產(chǎn)的最適溫度不同。同時(shí)，D阿拉伯糖醇是一種多元糖醇，在抵御高溫條件引起的刺激中起著非常重要的作用。因此該試驗(yàn)運(yùn)用變溫控制以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)、D阿拉伯糖醇合成以及產(chǎn)生的D阿拉伯糖醇保護(hù)機(jī)體自身的作用3方面的要求，以提高細(xì)胞反應(yīng)過(guò)程中目標(biāo)產(chǎn)物的量，結(jié)果見(jiàn)。

變溫調(diào)控對(duì)D阿拉伯糖醇產(chǎn)量和菌體生物量的影響由可知，37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，升溫到48 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再降溫至34 ℃繼續(xù)發(fā)酵96 h，細(xì)胞干重和D阿拉伯糖醇產(chǎn)量分別為5.26 g/L和114.92 g/L。細(xì)胞干重相比37 ℃（5.32 g/L）和34 ℃（5.09g/L）變化不明顯；但相比于48 ℃恒溫發(fā)酵（3.21 g/L）提高了2.09倍。D阿拉伯糖醇產(chǎn)量相比37 ℃恒溫發(fā)酵（88.23 g/L）、48 ℃恒溫發(fā)酵（37.23 g/L）和34 ℃恒溫發(fā)酵（95.03 g/L）分別提高了30.25%、208.66%、20.93%。這表明，變溫發(fā)酵培養(yǎng)可以影響菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的生成，適時(shí)的高溫刺激可以促使菌體大量合成D阿拉伯糖醇，以應(yīng)對(duì)外界不良環(huán)境的變化，達(dá)到自我保護(hù)的目的。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)多形漢遜酵母DL1發(fā)酵生產(chǎn)D阿拉伯糖醇過(guò)程的初步研究，根據(jù)溫度對(duì)微生物細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物代謝過(guò)程的影響，結(jié)合細(xì)胞生長(zhǎng)的最適溫度、產(chǎn)物生成的最適溫度以及發(fā)酵培養(yǎng)基組分的影響，獲得了一種提高多形漢遜酵母DL1發(fā)酵生產(chǎn)D阿拉伯糖醇產(chǎn)量的方法，采用該方法發(fā)酵結(jié)束后細(xì)胞干重和D阿拉伯糖醇產(chǎn)量分別為5.26 g/L和114.92 g/L。D阿拉伯糖醇產(chǎn)量分別比恒溫發(fā)酵（37、48、34 ℃）提高了30.25%、208.66%、20.93%；細(xì)胞干重相比37 ℃恒溫發(fā)酵和34 ℃恒溫發(fā)酵變化不明顯，相比于48 ℃恒溫發(fā)酵提高了2.09倍。該研究提供的方法為利用多形漢遜酵母DL1發(fā)酵生產(chǎn)D阿拉伯糖醇提供實(shí)踐依據(jù)。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年參考文獻(xiàn)

[1] 金樹(shù)人，李瑛，夏桂珍，等.糖醇生產(chǎn)技術(shù)與應(yīng)用[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2008.

[2] JAVIER ESCALANTE，GLORIA CAMINAL，MARTA FIGUEREDO，et al.Production of Arabitol from Glucose by Hansenula polymorpha[J].Journal of Fermentation and Bioengineering，1990，70（4）：228-231.

[3] TOKUOKA K.Sugarand salttolerant yeasts[J].The Journal of Applied Bacteriology，1993，74：101-110.

[4] ESCALANTE J，CAMINAL G， FIGUEREDO M，et al.Production of arabitol from glucose by Hansenula PolymorPha[J].Journal of Fermentation and Bioengineering，1990，70：228-231.

[5] FUJIWARA A，MASUDA S.Process for Producing Darabitol：US，4271268[P].1981.

[6] BERNARD E M， CHRISTIANSEN K J， TSANG S F，et al.Rate of Arabinitol Production by pathogenic yeast species[J].Journal of Clinical Microbiology，1981，14：189-194.

[7] ONISHI H，SUZUKI T.Microbial Production of xylitol from glucose[J].Applied Microbiology，1969，18（6）：1031-1035.

[8] SAHA B C，SAKAKIBARA Y.Production of Darabitol by a newly isolated Zygosaccharomyces rouxii[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2007，34：519-523.

[9] 宋衛(wèi)斌.D阿拉伯醇生產(chǎn)菌的選育、工藝優(yōu)化及其關(guān)鍵酶基因的克隆、表達(dá)[D].杭州：浙江大學(xué)，2011.

[10] 唐曉芳，張國(guó)棟，王剛. Hansenola anomala轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)阿拉伯糖醇的研究[J].食品工業(yè)科技，2012（1）：314-317.

[11] 李澤.產(chǎn)D阿拉伯醇酵母菌株的篩選及發(fā)酵條件研究[D].濟(jì)南：山東輕工業(yè)學(xué)院，2012.

[12] 蔡莉，張揚(yáng)，朱宏陽(yáng)，等.一株產(chǎn)D阿拉伯糖醇的菌株的分離篩選及鑒定[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（1）：23-26.

[13] 尤翠萍，張梁，丁重陽(yáng)，等.表面活性劑對(duì)D阿拉伯糖醇發(fā)酵的影響[J].生物加工過(guò)程，2011，9（2）：18-22.

[14] GELLISSEN G.Heterologous protein production in methylotrophic yeasts[J].Applied Microbiol Bitechnol，2000，54：741-750.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（23）：