張總澤 李敏 林陽武等

摘要[目的] 篩選一種高效、簡單、快速、價(jià)格合理的白蟻基因組DNA提取方法。[方法]比較了CTAB法、離心柱試劑盒和磁珠法試劑盒提取白蟻基因組DNA的效果。[結(jié)果]對于新鮮和保存得當(dāng)?shù)臉?biāo)本，3種方法提取的DNA質(zhì)量均較好；但對于保存時(shí)間較長，出現(xiàn)降解的標(biāo)本， 磁珠法試劑盒的效果明顯優(yōu)于其他方法。[結(jié)論] 獲得分子檢測所需要的最佳DNA提取方法。

關(guān)鍵詞白蟻；DNA；提取

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）23-07714-02

基金項(xiàng)目福建檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目（FK201224）；質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201410076）。

作者簡介張總澤（1984- ），男，內(nèi)蒙古牙克石人，農(nóng)藝師，碩士，從事昆蟲檢疫鑒定工作。

收稿日期20140620獲得高質(zhì)量的DNA模板是昆蟲分子鑒定成功的基本前提，直接關(guān)系到鑒定工作的成敗?？诎稒z疫工作中，有時(shí)截獲的昆蟲已經(jīng)死亡，細(xì)胞內(nèi)的DNA發(fā)生降解；有時(shí)截獲的昆蟲數(shù)量很少，可能只有1頭或者部分殘?bào)w，只能取部分組織用作提取DNA；有些實(shí)驗(yàn)室由于沒有考慮到要開展分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，對標(biāo)本簡單地干燥保存或乙醇浸泡常溫保存，使得標(biāo)本在用傳統(tǒng)方法進(jìn)行DNA提取時(shí)，提取結(jié)果無法滿足試驗(yàn)需要，使后續(xù)試驗(yàn)難以進(jìn)行。

目前常用的昆蟲DNA提取方法可以分為3類，即傳統(tǒng)的化學(xué)試劑法、離心柱試劑盒和磁珠法試劑盒。傳統(tǒng)的酚一氯仿法、CTAB法、KAc法、鹽析法和SDS法等提取DNA，操作復(fù)雜而耗時(shí)，DNA回收率低，無法充分去除對PCR試驗(yàn)的抑制因子，且對人體存在潛在的危險(xiǎn)性。目前，各實(shí)驗(yàn)室常用的離心柱法DNA提取試劑盒，可應(yīng)用于1～100 mg動(dòng)物組織DNA的快速提取，全程只需要2 h左右，高效快速，但對于微量組織和長期保存標(biāo)本的DNA提取效果不盡如人意?；诖胖榉ǖ腄NA提取方法是近年興起的一種新技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)、醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域，該方法以納米磁珠為DNA載體，將分離技術(shù)和富集技術(shù)有機(jī)地結(jié)合在一體，通過簡單的洗脫即可以得到高純度DNA，具有很好的應(yīng)用前景[1-3]。

對于白蟻而言，口岸檢驗(yàn)檢疫中很難截獲大量蟲體，在進(jìn)行分子鑒定時(shí)，為了保存標(biāo)本的完整性，需要保留作為主要鑒定特征的頭、胸部，僅利用足來提取DNA。另外，貿(mào)易便利化和快速通關(guān)對檢測周期提出越來越高的要求，需要尋找一種快速、高效、穩(wěn)定的白蟻DNA提取方法。筆者比較了CTAB法、離心柱試劑盒和磁珠法試劑盒提取白蟻DNA的效果，對所獲得的DNA進(jìn)行了質(zhì)量和純度等方面的檢測分析，以期獲得分子檢測所需要的最佳DNA提取方法。

1材料與方法

1.1供試蟲源及保存方式所用白蟻及保存方式見。

供試白蟻種類及有關(guān)信息

試蟲產(chǎn)地時(shí)間保存方式臺(tái)灣乳白蟻福州某木器廠200210無水乙醇浸泡，常溫保存黑翅土白蟻福州溫泉公園201403無水乙醇浸泡，常溫保存

1.2DNA提取方法

1.2.1CTAB法。參照姜麗紅等[4]的方法，取單頭白蟻，解剖鏡下挑取足部，放入1.5 ml離心管中，加入液氮，用融化的槍頭做研磨棒，充分研磨。加入800 μl 65 ℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液（0.1 mol/L CTAB，0.02 mol/L TrisHCl（pH 8.0），0.5% NaCl，0.2% β巰基乙醇），混勻，每5 min輕輕振蕩幾次，20 min后12 000 r/min離心15 min；小心吸取上清液，加入等體積的酚和氯仿（各400 μl）溶液，混勻，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；小心吸取上清液，加入等體積的氯仿，混勻，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；重復(fù)上一步驟1～2次，以蛋白層不出現(xiàn)為止；取上清，-20 ℃沉淀1 h，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2次；室溫下干燥30 min，溶于50 μl去離子水中，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2離心柱試劑盒。選用天根血液組織細(xì)胞基因組提取試劑盒（DP304），蟲體取樣、粉碎方法同“1.2.1”，按照試劑盒說明書操作，最后用50 μl洗脫緩沖液洗脫DNA。

1.2.3磁珠法試劑盒。選用天根磁珠法基因組提取試劑盒（DP329），蟲體取樣、粉碎方法同“1.2.1”，按照試劑盒說明書操作，最后用50 μl洗脫緩沖液洗脫DNA。

1.3DNA純度及濃度檢測將提取后的DNA樣品稀釋100倍，采用核酸蛋白分析儀（Amersham Biosciences ULTROSPEC1100）測定DNA在波長260與280 nm處的吸收值，根據(jù)OD260/OD280值判斷DNA的純度。當(dāng)OD260/OD280值低于1.6時(shí)，樣品中有蛋白質(zhì)或酚的污染；高于1.9則說明樣品中有RNA污染。

1.4PCR擴(kuò)增選用白蟻16SrRNA通用引物L(fēng)RJ13007（5TTACGCTGTTATCCCTAA3）和LRN13398（5CGCCTGTTTATCAAAAACAT3）對所提取的模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，目的片段約430 bp。PCR反應(yīng)體系：2.5 μl的10×PCR緩沖液、0.5 μl的dNTP混合物、引物各1 μl、1.25 units TaqDNA聚合酶、DNA模板2.5 μl，最后用ddH2O補(bǔ)充至25 μl。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃5 min；35個(gè)循環(huán)（94 ℃1 min；退火52 ℃30 s；延伸72 ℃1 min）；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存[5]。取10 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖凝膠上以100 V電泳分離30 min，染色后在凝膠成像儀上觀察結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1DNA純度與濃度利用分光光度計(jì)法，測定了3種方法提取到的DNA的純度與濃度（）。由可知，對于新采集的黑翅土白蟻，3種方法均可以提取到較高質(zhì)量的DNA，OD260/OD280在1.78～1.85，差別不大；DNA濃度以CTAB法提取的最大，達(dá)1 545 μg/ml，離心柱試劑盒提取的最低，為147 μg/ml。對于保存時(shí)間較長的臺(tái)灣乳白蟻，3種方法提取的DNA質(zhì)量均顯著下降，OD260/OD280均低于1.6，說明有蛋白質(zhì)或酚的污染；DNA濃度仍是CTAB法最高，達(dá)67 μg/ml，離心柱試劑盒最低，為26 μg/ml。

不同方法提取白蟻基因組DNA的純度與濃度

試蟲CTAB法OD260/OD280DNA濃度∥μg/ml離心柱試劑盒OD260/OD280DNA濃度∥μg/ml磁珠法試劑盒OD260/OD280DNA濃度∥μg/ml臺(tái)灣乳白蟻1.54671.38261.5743黑翅土白蟻1.7815451.851471.82352

2.2PCR結(jié)果利用通用引物擴(kuò)增了3種方法提取到DNA的16SrRNA片段，結(jié)果見。由可知，對于新采集的黑翅土白蟻，3種方法提取的DNA均可以擴(kuò)增出1條明亮的長度約430bp的條帶；但對于保存時(shí)間較長的臺(tái)灣乳白蟻，CTAB法和離心柱試劑盒提取的DNA幾乎均未擴(kuò)增出條帶，而磁珠法提取的DNA擴(kuò)增出清晰的條帶。

注：M.Marker；1～3.CTAB法、離心柱法和磁珠法提取的臺(tái)灣乳白蟻擴(kuò)增結(jié)果；4～6.CTAB法、離心柱法和磁珠法提取的黑翅土白蟻擴(kuò)增結(jié)果。

不同方法提取白蟻基因組DNA的擴(kuò)增結(jié)果3討論

經(jīng)過對3種提取方法的比較，結(jié)果表明，從提取質(zhì)量的角度看，磁珠法最好，特別是對于長期保存、出現(xiàn)降解的樣品，磁珠法能減少DNA損失，提取出高質(zhì)量的DNA，滿足鑒定需要，而CTAB法和離心柱法的效果較差；從環(huán)保安全的角度看，CTAB法使用酚和氯仿，對人身和環(huán)境都有害。雖然離心柱法和磁珠法無法做到“零排放”，但兩者在環(huán)保方面明顯優(yōu)于CTAB法；從提取成本的角度看，經(jīng)濟(jì)成本方面，提取單個(gè)樣品CTAB法為3元，離心柱法為8.4元，磁珠法為12元；時(shí)間成本方面，提取單個(gè)樣品CTAB法約3.5 h，離心柱法約1.5 h，磁珠法約1 h。

貿(mào)易便利化對檢疫鑒定工作的“準(zhǔn)、快”提出了越來越高的要求，應(yīng)用分子生物學(xué)方法是口岸檢疫鑒定白蟻工作的重要補(bǔ)充手段，而獲得高質(zhì)量的DNA模板是基本前提。綜合以上因素，建議口岸部門在白蟻檢疫鑒定工作中，采用如下策略：如果樣品較為新鮮，或數(shù)量較多，可以用單頭白蟻提取DNA時(shí)，推薦使用離心柱型試劑盒；如果樣品質(zhì)量較差，或僅有1頭樣品，只能將足用作DNA提取時(shí)，推薦使用磁珠法試劑盒。

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