符群 彭亞文 王振宇

摘要

[目的]了解紅松多酚對免疫細胞功能的影響。[方法]采用MTT法研究了紅松多酚對大鼠脾淋巴細胞增殖能力的影響，以中性紅吞噬試驗考察了紅松多酚對大鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響。[結果]研究表明，隨著給藥劑量的增加，紅松多酚對機體免疫細胞具有活性促進作用。劑量濃度達到0.3 mg/ml時，脾淋巴細胞增殖呈現(xiàn)極顯著增加（P<0.01），腹腔巨噬細胞的吞噬中性紅能力亦呈現(xiàn)極顯著增強（P<0.01）。并且在一定濃度范圍內，作用效果均呈現(xiàn)劑量-效果關系。[結論]紅松多酚對于機體的免疫細胞活性具有促進作用。

關鍵詞紅松；多酚；免疫

中圖分類號S609.9文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）28-09920-02

The Influence of Korean Polyphenols on Immune Cells Viability

FU Qun1， PENG Yawen1， WANG Zhenyu2*（1. School of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040； 2. School of Food Science and Engineering， Harbin Institute of Technology， Harbin， Heilongjiang 150090）

Key words[Objective] To study the influence of Korean polyphenols on immune cells viability. [Method] This experiment used MTT method to study the influence of Korean polyphenols on spleen lymphocytes viability in rats and used the neutral red phagcytosis method to test the influence of Korean polyphenols on the peritoneal macrophages phagocytic ability. [Result] The result showed that， as the increasing of the dose， Korean polyphenols could significantly enhance the active of immune cells. When the concentration reached more than 0.3 mg/ml， the spleen lymphocytes increased remarkably （P<0.01） and the phagocytic ability of peritoneal macrophages on the neutral red increased remarkably （P<0.01）. And in some certain concentration， effects were present doseeffect relationship. [Conclusion] Korean polyphenols could enhance the viability of immune cells in the body.

Key wordsKorean pine； Polyphenols； Immune

隨著當今社會的不斷發(fā)展，人們生活工作節(jié)奏日漸加快，環(huán)境污染日益嚴重，人們的亞健康及患病機率也隨之大幅度增加。無論對于亞健康人群和患病人群，機體免疫能力的重要作用不亞于藥物本身的作用，而且完全依靠藥物治療，對機體的副作用往往不可忽視[1]。目前，國內外研究者對于具有免疫功能的物質的關注度不斷加強[2]，并致力于天然產(chǎn)物活性物質的研究。已有研究結論表明，紅松諸多部位可以作為人們祛病強身、延年益壽的藥食兩用材料，松屬植物具有較強免疫功能的生物活性，其中最主要的有效成分即為多酚類和多糖類[3-4]。我國紅松在東北地區(qū)分布較為廣泛，其種子由于營養(yǎng)豐富頗受人們歡迎，但是食用松仁之后，紅松種鱗殼則基本屬于廢棄物，紅松的種皮、樹皮、果鱗等不同部位皆含有不同量的多酚類化合物[5]，未能得到充分地利用，造成了資源的大量浪費。筆者對紅松鱗片中的多酚物質進行研究，既實現(xiàn)了資源的高效利用，又對松多酚免疫作用進行了初步研究，促進其藥食用途的產(chǎn)業(yè)化進程。

1 材料與方法

1.1材料

紅松種鱗，2012年采自長白山地區(qū)（42°10′ N，126°32′ E）；Wistar大鼠，黑龍江省中醫(yī)藥大學藥物評價中心提供；RPMI1640培養(yǎng)液，Gibco公司；MTT、ConA，均來自Sigma公司； Hanks液，北京百浩生物公司；中性紅染液、臺盼蘭，均來自南京森貝嘉生物公司。

1.2方法

1.2.1

紅松種鱗多酚的制備。

取紅松種鱗，粉碎過60目篩，以石油醚2次脫脂，稱取脫脂后的紅松種鱗2 g于100 ml燒杯中，加入60 ml 50%（V/V）乙醇，以1∶30（M/V）的料液比，60 ℃水浴下提取60 min。采用硅膠柱層析法，以甲醇為洗脫劑，將提取液純化，真空旋轉蒸發(fā)去除溶劑，采用福林酚法[6]測定純化多酚含量，收集多酚冷凍干燥備用。

1.2.2

大鼠脾淋巴細胞體外增殖研究。

1.2.2.1

脾淋巴細胞的收集與培養(yǎng)。于無菌條件下取大鼠脾組織，去除脂肪等附著物，以無菌PBS液清洗3次。針筒塞輕輕磨碎脾組織，過200 目無菌篩網(wǎng)過濾細胞，使其形成單個細胞。用PBS液洗滌細胞 2 次，每次3 ml，離心 10 min，速度為 1 000 r/min。然后將細胞重懸于1 ml 新鮮RPMI1640培養(yǎng)液中，用臺盼蘭染色法[7]記錄活細胞數(shù)量在95%以上，調整細胞濃度為1.0×106個/ml[8]。

1.2.2.2

脾淋巴細胞增殖試驗。將調整好濃度的脾淋巴細胞懸浮液分別加入到 96 孔培養(yǎng)板中，每孔95 μl，培養(yǎng)過夜。待脾細胞貼壁生長后，加入純化多酚，調整每水平的終濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/ml，每水平中3孔加入5 μl ConA 溶液（使其終濃度為 7.5 μg/ml），另外3孔作為對照，加入5 μl PBS緩沖溶液，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結束前4 h，每孔加入10 μl MTT（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，離心去除上清，每孔加入150 μl DMSO，振蕩培養(yǎng)15 min，使紫色結晶完全溶解，用酶標儀在 490 nm 波長下測定反應溶液的吸光度值[9]。

1.2.3

大鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力研究。

1.2.3.1

巨噬細胞的收集與培養(yǎng)。無菌條件下腹腔注射10 ml 無菌Hanks 液，輕揉鼠腹，約10 min后，吸取液體收集至15 ml離心管中，離心棄上清，以RPMI1640培養(yǎng)基重新懸浮沉淀物[10]。

1.2.3.2

大鼠巨噬細胞吞噬增殖反應試驗。

調整細胞濃度每孔100 μl接種至96孔板中，培養(yǎng)過夜。待巨噬細胞貼壁后，加入純化多酚，調整每水平的終濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/ml，各水平分別做3孔平行。培養(yǎng)24 h后，每孔加入中性紅100 μl，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 30 min后，用Hanks 液清洗，4 ℃冰箱過夜后，在490 nm波長下，酶標儀測定OD值[11]。

對于試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件分析組間差異顯著性。

2 結果與分析

2.1大鼠脾淋巴細胞體外增殖研究

脾臟是機體內重要的免疫器官，富含 T、 B 淋巴細胞，加之其易于分離，是體外試驗中淋巴細胞的重要來源。測定淋巴細胞體外增殖反應是檢測淋巴細胞功能的常用方法。該試驗采用MTT法對大鼠脾淋巴細胞進行增殖試驗，各劑量組吸光值結果如表1所示。

由表1可知，相比空白組，各紅松多酚劑量組對機體淋巴細胞均有促進其增殖的作用。采用SPSS18.0軟件進行組間差異性分析可知，當紅松多酚劑量濃度達到0.3 mg/ml以上時，與空白組相比，淋巴細胞增殖的差異達到極顯著水平（P<0.01）。而在0.1～0.4 mg/ml濃度范圍內，也呈現(xiàn)差異的顯著性（P<0.05），且呈現(xiàn)劑量與效果之間的正相關關系。因此可知，紅松多酚對于淋巴免疫細胞體外有促進增殖作用，且隨多酚濃度提高，刺激作用不斷增強，表明紅松多酚對脾淋巴細胞增殖活性呈現(xiàn)明顯劑量依賴性。

2.2大鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能研究

巨噬細胞作為機體免疫系統(tǒng)的重要組成成分，在體液免疫和細胞免疫中發(fā)揮中心作用。它可以直接吞噬外來異物及衰老的自身細胞，還可分泌白介素等細胞因子，進而發(fā)揮抗病毒、 抗腫瘤作用。紅松多酚干預后的大鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能試驗吸光值數(shù)據(jù)如表2所示。

由表2數(shù)據(jù)可知，紅松多酚干預巨噬細胞后，對于巨噬細胞的吞噬功能有一定影響。以SPSS18.0軟件進行顯著性分析可知，當紅松多酚給藥濃度達到0.3 mg/ml以上時，巨噬細胞的吞噬功能與空白組相比，呈現(xiàn)極顯著的差異（P<0.01），而在0.1～0.2 mg/ml濃度范圍中未呈現(xiàn)顯著的差異。一般認為，巨噬細胞的代謝狀況和其吞噬能力直接相關，代謝旺盛，則說明巨噬細胞的吞噬能力增強；代謝減弱，則吞噬功能下降。因此該試驗數(shù)據(jù)表明，紅松多酚對于機體巨噬細胞的代謝能力有促進，對于劑量具有一定依賴性，且對劑量的反應極敏感。

3結論

該試驗通過MTT淋巴細胞增殖試驗和大鼠巨噬細胞吞噬增殖反應試驗驗證了紅松多酚對脾淋巴細胞和大鼠巨噬細胞的增殖具有促進作用。試驗結果表明，紅松多酚對脾淋巴細胞具有顯著（P<0.05）促進增殖的作用，且在0.1～0.4 mg/ml濃度范圍內呈現(xiàn)出劑-效關系。巨噬細胞作為機體主要的免疫細胞，既可以直接吞噬外來異物及衰老的自身細胞，又可分泌白介素等細胞因子，進而發(fā)揮抗病毒、 抗腫瘤作用。試驗結果同時表明，紅松多酚對于腹腔巨噬細胞具有增強其代謝能力的作用，且在0.3 mg/ml濃度以上，作用極顯著（P<0.01）。通過機體具有代表性的免疫細胞活性研究，初步表征了紅松多酚作為一種天然產(chǎn)物，具有較強的機體免疫細胞活性促進作用。

在藥物研究趨勢由化學合成藥物轉向天然藥物的今天，到目前為止研究者已對多種植物多酚進行了結構、活性作用機理等研究。該試驗的結論為紅松多酚作為良好的免疫促進劑類保健品或藥物提供了科學依據(jù)，表明對紅松多酚的進一步研究與開發(fā)具有科學和實用意義。

參考文獻

[1]

楊澍，洪閣，劉天軍.植物多酚類物質的生物學活性研究進展[C]//中國科學技術協(xié)會、貴州省人民政府.第十五屆中國科協(xié)年會第21分會場：中藥與天然藥物現(xiàn)代研究學術研討會論文集.中國科學技術協(xié)會，貴州省人民政府，2013：6.

[2] SEIFRIEDH E，ANDERSOND E，F(xiàn)ISHERE I，et al.A review of the interaction among dietary antioxidants and reactive oxygen species [J].Journal of Nutritional Biochemistry，2007，18（9）：567-579.

[3] CHIVA-BLANCH G，URPI-SARDA M，LLORACH R，et al.Differential effects of polyphenols and alcohol of red wine on the expression of adhesion molecules and inflammatory cytokines related to atherosclerosis：a randomized clinical trial[J].American Journal of Clinical Nutrition，2012，95（2）：326-334.

[4] WENG C J，YEN G C.Chemo preventive effects of dietary phytochemicals against cancer invasion and metastasis：phenolic acids，monophenol，polyphenol，and their derivatives[J].Cancer Treatment Reviews，2012，38（1）：76-87.

[5] 魯玉妙，馬惠玲.我國植物多酚研究文獻計量及研究熱點分析[J].食品科學，2012（17）：290-296.

[6] SILICI S，SAGDIC O，EKICI L.Total phenolic content，antiradical，antioxidant and antimicrobial activities of Rhododendron honeys[J] .Food Chemistry，2009，121（1）：238-243.

[7] BYUNGCHEON LEE，KI HOON EOM，KWANGSUP SOH.In situ staining of the primo vascular system in the ventricles and subarachnoid space of the brain by trypan blue injection into the lateral ventricle[J].Neural Regeneration Research，2011，28：2171-2175.

[8] 周革非，魏元臣，孔娜娜，等.λ卡拉膠降解組分的分離純化、抗氧化及免疫活性研究[J].海洋科學，2009（8）：58-62.

[9] 周菲，李海濤，尹鴻萍.蝙蝠蛾被孢菌絲體多糖對小鼠免疫細胞的影響[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2011（3）：41-44.

[10] 李麗，馬偉偉，曲雁，等.海黍子乙酸乙酯相提取物的抑菌和體外免疫活性的研究[J].海洋科學，2013（12）：47-51.

[11] 王凌，孫利芹，周妍.小球藻多糖體外免疫調節(jié)活性研究[J].食品研究與開發(fā)，2013（7）：30-33.