韓業(yè)昊 張超 凌慶枝

摘要 [目的]研究靈芝（Ganoderma lucidum）固體發(fā)酵所得漆酶粗酶液對(duì)蒽醌染料進(jìn)行脫色的條件。[方法]分別研究不同的pH、染料濃度、溫度、酶用量、反應(yīng)時(shí)間等條件對(duì)活性艷色藍(lán)XBR染料脫色的影響。[結(jié)果]脫色的適宜條件為：在 pH 3.5、40 ℃、60 U/ml靈芝漆酶、200 mg/L染料濃度的條件下反應(yīng)5 h，活性艷色藍(lán)XBR染料脫色率可達(dá)49%。[結(jié)論]靈芝固體發(fā)酵的漆酶粗酶液在一定條件下對(duì)蒽醌染料活性艷色藍(lán)XBR具有較好的脫色效果。

關(guān)鍵詞 靈芝漆酶；活性艷色藍(lán)XBR；脫色

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）26-08875-03

Study on the Decolorized Condition on Reactive Brilliant Blue XBR by Laccase of Ganoderma lucidum

HAN Yehao， LING Qingzhi et al

（Medical College Anhui University of Science and Technology， Huainan， Anhui 232001； Zhejiang Pharmaceutical College， Ningbo， Zhejiang 315100）

Abstract [Objective] Decolorization of anthraquinone dye with laccase from Ganoderma lucidum was studied. [Method] Effects of different pH， dye concentrations， temperature， enzyme dosage， reaction time on decolorization of Reactive Brilliant Blue XBR were studied. [Result] The optimal conditions of decolorization are： pH 3.5， 40 ℃， 60 U/ml Ganoderma laccase and 200 mg/L dye concentration， respectively. Under the above conditions， the decolorization rate of Reactive Brilliant Blue XBR was 49% after 5 h catalyzation with the laccase from G. lucidum. [Conclusion] Ganoderma laccase under optimal conditions for Reactive Brilliant Blue XBR has a decolorization effect.

Key words Ganoderma lucidum； Reactive Brilliant Blue XBR； Decolorization

漆酶（E.C.1.10.3.2）是一類含銅的氧化還原酶，一般存在于真菌和植物中。它具有較大的應(yīng)用價(jià)值，在造紙、紡織、食品等領(lǐng)域越來越受到人們的重視^[1-4]。XBR是一種蒽醌類染料，為綠光藍(lán)色粉末，染品色澤鮮艷，主要用于棉、粘膠、蠶絲等纖維的染色。蒽醌類染料的廢水色度高，成分復(fù)雜，其芳香結(jié)構(gòu)不易被破壞，可生化性差，脫色較慢，并且廢水中含有有機(jī)染料，毒性強(qiáng)，pH波動(dòng)大，組分變化大，是目前廢水治理中的難點(diǎn)之一^[5]。目前，利用漆酶對(duì)蒽醌類染料降解的研究日益受到關(guān)注^[6-9]。朱林等^[10]利用真菌5319產(chǎn)漆酶對(duì)蒽醌類和偶氮類染料進(jìn)行了脫色研究，取得較好的效果。趙美麗^[11]利用白腐真菌對(duì)印染類染料處理進(jìn)行了研究，取得一定的效果。

筆者對(duì)靈芝漆酶對(duì)蒽醌類染料降解的條件進(jìn)行優(yōu)化，找出降解率較高的優(yōu)化條件，提高降解效率，為靈芝漆酶降解蒽醌類染料研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種。靈芝（Ganoderma lucidum）菌種，由廣西大學(xué)提供，浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校生物藥物研究所保藏。

1.1.2 染料。

活性艷色藍(lán)XBR（Reactive Brilliant Blue XBR）染料，由武漢三染染料有限公司提供。

1.1.3 化學(xué)試劑。

ABTS[2，2′連氮-二（3乙基苯并噻唑6磺酸）]，分析純，Sigma 公司產(chǎn)品；醋酸、醋酸鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器。

冷凍離心機(jī)，Thermo公司；TU1810SPC紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器公司；酶標(biāo)儀，Thermo 公司；BSA2245CW電子天平，Sartorius 公司；Starter 3C酸度計(jì)，奧豪斯（上海）公司；HH2數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器公司；Crystal ISRDH恒溫振蕩器，精騏儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制備。

采取常規(guī)法固體發(fā)酵靈芝，取固體發(fā)酵菌絲體，用研缽磨碎后按1∶10在蒸餾水中浸泡24 h，用8層紗布過濾，在12 000 r/min常溫離心10 min，取上清液即為粗酶液。

1.2.2 漆酶酶活的測(cè)定。

靈芝漆酶酶活力定義：每分鐘催化1 μmol ABTS氧化所需的酶量為一個(gè)酶活力單位，單位以U/ml表示。根據(jù)文獻(xiàn)[12]，以ABTS為底物的標(biāo)準(zhǔn)曲線法，先采用粗的靈芝漆酶與不同濃度的ABTS底物反應(yīng)足夠長的時(shí)間后，在420 nm處測(cè)定不同濃度ABTS自由基溶液對(duì)應(yīng)的吸光值（A），繪制ABTS自由基濃度—吸光值曲線（圖1）。

根據(jù)酶活力定義和圖1，可以得到酶活力計(jì)算公式：

漆酶酶活力=1 000×[0.087×△A+0.002]×稀釋倍數(shù)/△t

式中，酶活力單位為U/（mol·min）；△A為內(nèi)反應(yīng)前后吸光度變化差值；△t為反應(yīng)時(shí)間。再用反應(yīng)體系總體積 4 ml，包括0.5 ml 0.2 mol/L pH 4.5 醋酸-醋酸鈉緩沖液、3 ml 0.5 mmol/L ABTS，其中ABTS由0.2 mol/L pH 4.5 醋酸-醋酸鈉緩沖液溶解配制，0.5 ml 用緩沖液適當(dāng)稀釋的酶粗提液，測(cè)定反應(yīng)的前 3 min內(nèi)反應(yīng)液在 420 nm 處吸光值OD的增加量，以滅活酶液做空白對(duì)照。試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值，計(jì)算酶活力。

1.2.3 活性艷色藍(lán)XBR吸收光譜的測(cè)定。

用 0.2 mol/L pH 3.5 醋酸-醋酸鈉緩沖液配制200 mg/L活性艷色藍(lán)XBR。測(cè)定時(shí)，稀釋到線性范圍內(nèi)，以醋酸-醋酸鈉緩沖液為空白對(duì)照，進(jìn)行紫外波長掃描（圖2），活性艷色藍(lán)XBR的最大吸收峰在 600 nm 處。因此，研究中所有脫色率均以在600 nm處所測(cè)的吸光度OD值來計(jì)算。

1.2.4 染料脫色率的計(jì)算。

參照漆酶酶活檢測(cè)體系設(shè)置4 ml 脫色反應(yīng)體系。脫色體系中以 0.2 mol/L 醋酸-醋酸鈉緩沖液配制活性艷色藍(lán)XBR，最后加入靈芝漆酶粗酶液啟動(dòng)反應(yīng)，在所需溫度和條件下靜置反應(yīng)一段時(shí)間后，測(cè)定脫色反應(yīng)后的溶液在 600 nm 處的吸光度。在相同試驗(yàn)條件下，加入等量 100 ℃滅活 10 min 的酶液作為空白對(duì)照，測(cè)定其吸光度，按以下公式計(jì)算不同脫色條件下的脫色率。

脫色率（%）=（A₀-A₁）/A₀×100

式中，A₀為醋酸-醋酸鈉緩沖液添加染料在600 nm的OD值；A₁為脫色反應(yīng)后的OD值。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對(duì)靈芝漆酶粗酶液催化活性艷色藍(lán)XBR脫色的影響

在脫色反應(yīng)體系中，分別用 pH 為 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 的0.2 mol/L 醋酸-醋酸鈉為緩沖液，保持其他條件不變，對(duì)活性艷色藍(lán)XBR進(jìn)行脫色降解5 h。由圖3可知，pH在3.5～4.5之間脫色效果較好，脫色率在35%以上；當(dāng) pH為 3.5 時(shí)，脫色率最高為41.53%。因此，確定其脫色最適pH為3.5。

2.2 染料濃度對(duì)靈芝漆酶粗酶液催化活性艷色藍(lán)XBR脫色的影響

采用上述最適 pH 3.5、溫度和漆酶用量，保持其他條件不變，分別對(duì)濃度為50、100、150、200、250、300、350 mg/L活性艷色藍(lán)XBR進(jìn)行脫色處理 2 h。由圖4可知，隨著染料濃度的增加，脫色率呈先升后降的趨勢(shì)。當(dāng)活性艷色藍(lán)XBR的濃度為200 mg/時(shí)，脫色率最高，為48.78%。

入ABTS漆酶脫色率反而下降的現(xiàn)象一致。所以，加入

ABTS不利于靈芝漆酶對(duì)活性艷色藍(lán)XBR脫色反應(yīng)。另外，在最優(yōu)條件下用恒溫振蕩器振蕩反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)與靜止反應(yīng)區(qū)別不明顯。

3 結(jié)論

研究表明，靈芝漆酶粗酶液對(duì)活性艷色藍(lán)XBR具有一定的脫色效果，脫色的適宜條件為：pH 3.5、40 ℃、60 U/ml靈芝漆酶、200 mg/L染料濃度，此時(shí)蒽醌染料活性艷色藍(lán)XBR脫色率可達(dá)49%左右。

雖然目前對(duì)漆酶降解染料污水的研究取得一定的進(jìn)展，但由于染料污水情況復(fù)雜，漆酶在染料廢水降解中的應(yīng)用范圍仍不夠廣泛。此外，靈芝漆酶對(duì)XBR脫色率有待進(jìn)一步提高，在以后實(shí)際應(yīng)用方面還需要對(duì)漆酶進(jìn)行固定化處理以方便回收再利用。

參考文獻(xiàn)

[1] 鐘平方，彭惠民，彭方毅，等.漆酶催化酚類、苯胺類化合物的動(dòng)力學(xué)分析及其測(cè)定廢水中鄰苯二酚的應(yīng)用研究[J].環(huán)境科學(xué)，2010，31（11）：2673-2677.

[2] CRISTVO RO，TAVARES APM，RIBEIRO AS，et al.Kinetic modelling and simulation of laccase catalyzed degradation of reactive textile dyes[J].Biores Tech，2008，99（11）：4768-4774.

[3] HAO J，SONG F，HUANG F.Production of laccase by a newly isolated deuteromycete fungus Pestalotiopsis sp. and its decolorization of azo dye[J].J Ind Microbiol Biotechnol，2007，34（3）：233-240.

[4] BALDRIAN P.Fungal laccasesoccurrence and properties[J].FEMS Microbiology Reviews，2006，30：215-242.

[5] 何淼，況武，金祥福，等.蒽醌類染料廢水處理的幾種新技術(shù)[J].給水排水，2008，34（S1）：219-221.

[6] 王志新，施曉燕，蔡宇杰，等.白腐真菌SYBCL2漆酶的分離純化及其在毛紡染料脫色中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào)，2009（8）：156-161.

[7] 胡述浩，郭東會(huì)，朱啟忠.真菌產(chǎn)漆酶對(duì)蒽醌類染料脫色的研究[J].資源開發(fā)與市場(chǎng)，2013，29（12）：1237-1238，1269.

[8] 孫秋芳，趙亮亮，李燕榮，等.漆酶/ABTS介質(zhì)系統(tǒng)對(duì)蒽醌染料的脫色效果[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（1）：190-193.

[9] 侯紅漫，周集體，王競，等.白腐菌Pleurotus ostreatus漆酶對(duì)蒽醌染料SN4R脫色研究[J].大連理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，44（5）：640-645.

[10] 朱林，洪宇植，方澤民，等.真菌漆酶對(duì)蒽醌和偶氮類活性染料的脫色[J].中國科技論文在線，2010，5（3）：224-227.

[11] 趙美麗.白腐菌產(chǎn)漆酶及其對(duì)印染污水處理的研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2012.

[12] 張鵬.以ABTS為底物測(cè)定漆酶活力的方法[J].印染助劑，2007，24（1）：43-45.