張杰　劉永強(qiáng) 婁虎 郭瑞 劉雪峰

摘要

[目的]摸索出Nesterenkonia sp.DF1菌種的產(chǎn)淀粉酶的優(yōu)化發(fā)酵條件，為發(fā)酵工業(yè)中淀粉酶的大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)。[方法] 采用單因素和多因素正交試驗(yàn)的方法，考察發(fā)酵時(shí)間、溫度、初始pH、鹽度、碳源和氮源的改變對(duì)發(fā)酵產(chǎn)淀粉酶的影響。[結(jié)果]在裝液量100 ml/250 ml條件下， 得到產(chǎn)淀粉酶最佳條件為：玉米粉1%，酵母膏2%，初始pH 8.0、NaCl濃度3%、37.5 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。[結(jié)論] 該研究找到了產(chǎn)淀粉酶的最佳發(fā)酵條件。

關(guān)鍵詞中度嗜鹽菌；淀粉酶；發(fā)酵條件；優(yōu)化

中圖分類號(hào)Q938；S188+.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）28-09664-03

Optimizing Fermentation Conditions for Amylase Production Using Moderately Halophilic Bacterium Nesterenkonia sp.DF1

ZHANG Jie1， LIU Yongqiang2， LOU Hu1， LIU Xuefeng3* et al

（1. College of Life Sciences， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040； 2. Daqing City Center for Disease Control and Prevention， Daqing， Heilongjiang 163311；3.Forestry College，Northeast Forestry University，Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract[Objective] It was necessary for Nesterenkonia sp.DF1 to optimize the fermentation conditions for production of amylase in order to provide theoretical basis for the mass production of amylase in fermentation industry. [Method] The single factor method and multifactor orthogonal experiment were adopted to investigate the effect of a set of variables， including fermentation time， temperature， initial pH， salinity， the change of carbon source and nitrogen source upon the influence of fermentation to produce amylase. [Result] When liquid medium volume was 100 ml/ 250 ml， the optimal fermentation conditions were corn meal 1%， yeast extraction 2%， initial pH 8.0， NaCl concentration 3%， temperature 37.5 ℃ and shaking culture for 72 h at 160 r/min. [Conclusion] The best fermentation conditions for Nesterenkonia sp.DF1 to produce amylase were obtained.

Key words Moderately halophilic bacterium； Amylase； Fermentation conditions； Optimization

目前國(guó)內(nèi)對(duì)于嗜鹽菌產(chǎn)淀粉酶、酯酶、脂肪酶的相關(guān)報(bào)道很多，但這些菌大多數(shù)屬于極端嗜鹽菌，如Halobacterium sp.H371[1]、Halorubrum sp.CY[2]、Haloferax mediterranei R4[3]和Natronobacterium sp.C212[4]等，對(duì)于中度嗜鹽菌產(chǎn)生的酶方面的研究還不是很多，而且目前尚沒有對(duì)Nesterenkonia屬菌所分泌的胞外淀粉酶進(jìn)行系統(tǒng)的酶學(xué)性質(zhì)和發(fā)酵條件優(yōu)化研究。該研究彌補(bǔ)了這方面的不足，為發(fā)酵工業(yè)中淀粉酶的大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1

菌種。該實(shí)驗(yàn)室分離的中度嗜鹽菌高產(chǎn)淀粉酶的菌種Nesterenkonia sp.DF01。

1.1.2

培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基組成為：酵母粉6 g/L，酸水解酪蛋白5 g/L，蛋白胨6 g/L，KCl 3 g/L，檸檬酸鈉3 g/L， FeSO4 0.001 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L， NaCl 30～120 g/L（不同鹽度梯度），加蒸餾水至1 000 ml。淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：酸水解酪蛋白5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨6 g/L，酵母粉6 g/L，KCl 3 g/L，檸檬酸鈉3 g/L，F(xiàn)eSO4 0.001 g/L， MgSO4·7H2O 2 g/L， NaCl視需要量，加蒸餾水至1 000 ml。

1.2方法

1.2.1

單因素試驗(yàn)。挑取少許單菌落，接種于種子發(fā)酵液中， 140 r/min，37 ℃搖床培養(yǎng) 24～48 h，制備種子發(fā)酵液，按2%的接種量接種在裝有100 ml淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中， 160 r/min，37 ℃搖床培養(yǎng)。分別改變發(fā)酵時(shí)間、溫度、初始pH、鹽度，碳源和氮源，每個(gè)不同梯度樣品作3個(gè)平行，取酶活性的平均值[5-6]。

1.2.2

多因素正交試驗(yàn)。

采用L9（34）做正交試驗(yàn)，選擇碳源、氮源、NaCl濃度培養(yǎng)基和初始pH作為4個(gè)單因素，找出在多個(gè)因子共同作用（表1）下的中度嗜鹽菌產(chǎn)淀粉酶的最佳培養(yǎng)條件[7-8]

1.2.3

淀粉酶活性的測(cè)定。參照文獻(xiàn)[9]，測(cè)定淀粉酶活性。酶活性單位定義為：在最適反應(yīng)條件下反應(yīng)10 min，消化1 mg淀粉所需的酶量。

2結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)時(shí)間對(duì)DF01產(chǎn)淀粉酶的影響

由圖1可知，培養(yǎng)0～24 h時(shí)菌體生長(zhǎng)很慢，淀粉酶活性比較低；培養(yǎng)24～48 h時(shí)菌體迅速生長(zhǎng)，淀粉酶活性越來越高；培養(yǎng)48～72 h時(shí)菌體生長(zhǎng)很快，培養(yǎng)72 h時(shí)達(dá)到最大值，產(chǎn)酶量很高且保持穩(wěn)定，在培養(yǎng)72 h時(shí)也達(dá)到最高值；培養(yǎng)72～96 h時(shí)菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定，接近最大值，菌體培養(yǎng)到84 h之后產(chǎn)酶量緩慢下降；培養(yǎng)超過96 h時(shí)菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)酶量均有下降趨勢(shì)，因此培養(yǎng)72 h最佳。

圖1培養(yǎng)時(shí)間對(duì)DF01產(chǎn)淀粉酶的影響

2.2培養(yǎng)溫度對(duì)DF01產(chǎn)淀粉酶的影響

由圖2可知，當(dāng)溫度超過30 ℃時(shí)菌體生長(zhǎng)迅速，當(dāng)溫度達(dá)到37 ℃時(shí)菌體含量最大，38 ℃時(shí)產(chǎn)酶量接近最大值，因此最佳的產(chǎn)酶溫度為37.5 ℃，此時(shí)菌體生長(zhǎng)良好，產(chǎn)酶量也多。

圖2培養(yǎng)溫度對(duì)DF01產(chǎn)淀粉酶的影響

2.3培養(yǎng)基初始pH對(duì)DF01產(chǎn)淀粉酶的影響

由圖3可知，當(dāng)初始pH為7.5時(shí)，菌體生長(zhǎng)量接近最大值，產(chǎn)酶量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)初始pH為8.0時(shí)，產(chǎn)淀粉酶量接近最大值，菌體含量也接近最大值；當(dāng)初始pH超過8.0時(shí)，產(chǎn)酶量和菌體含量均下降。因此，培養(yǎng)基初始pH 8.0對(duì)DF01產(chǎn)淀粉酶的影響最佳。

圖3起始pH對(duì)產(chǎn)淀粉酶的影響

2.4NaCl濃度對(duì)DF01產(chǎn)淀粉酶的影響

由圖4可知，NaCl濃度在0～3%范圍內(nèi)產(chǎn)淀粉酶量差別不大，當(dāng)生長(zhǎng)鹽度為3%時(shí)菌體含量、產(chǎn)酶量菌接近最大值，當(dāng)NaCl濃度大于5%時(shí)菌體含量和產(chǎn)淀粉酶量均下降。因此，NaCl濃度為3%時(shí)對(duì)DF01產(chǎn)淀粉酶的影響最佳。

圖4NaCl濃度對(duì)產(chǎn)淀粉酶的影響

2.5碳源及其濃度對(duì)DF01產(chǎn)淀粉酶的影響

由圖5可知，DF01在相同的培養(yǎng)條件下，以玉米粉為唯一碳源配制培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體時(shí)產(chǎn)淀粉酶量最高，其次是以可溶性淀粉為唯一碳源，當(dāng)以葡萄糖為唯一碳源時(shí)產(chǎn)酶量最低。

圖5不同碳源對(duì)產(chǎn)淀粉酶的影響

由圖6可知，碳源的添加量不同，對(duì)產(chǎn)淀粉酶會(huì)有很大的影響，當(dāng)碳源玉米粉含量為1%時(shí)產(chǎn)淀粉酶量最高，超過1%時(shí)產(chǎn)酶量逐漸下降。

圖6玉米粉添加量對(duì)產(chǎn)淀粉酶的影響

2.6氮源及其濃度對(duì)DF01產(chǎn)淀粉酶的影響

由圖7可知，DF01在相同的培養(yǎng)條件下，以酵母膏為唯一氮源配制培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體時(shí)產(chǎn)酶量最高，其次以蛋白胨為唯一氮源，當(dāng)以尿素為唯一氮源時(shí)產(chǎn)酶量最低。

圖7不同氮源對(duì)產(chǎn)淀粉酶的影響

由圖8可知，氮源的添加量不同，對(duì)產(chǎn)淀粉酶有很大的影響，當(dāng)?shù)唇湍父嗪繛?%時(shí)產(chǎn)淀粉酶量最高，氮源含量過高或過低菌種產(chǎn)酶量會(huì)下降。

圖8氮源添加量對(duì)產(chǎn)淀粉酶的影響

2.7多因子正交試驗(yàn)分析

由表2可知，四因素對(duì)DF01產(chǎn)淀粉酶產(chǎn)生影響的大小順序?yàn)樘荚礉舛?氮源濃度>pH >NaCl濃度。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，產(chǎn)淀粉酶最佳條件為玉米粉1%，酵母膏2%，初始pH 8.0，NaCl 濃度3%。

3結(jié)論

結(jié)合單因素和四因素三水平正交試驗(yàn)，在裝液量100 ml/250 ml條件下， 得到產(chǎn)淀粉酶最佳條件為玉米粉1%，酵母膏2%，初始pH 8.0，NaCl濃度3%，37.5 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。該研究結(jié)果為今后中度嗜鹽菌菌種的生產(chǎn)應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。