劉華　申雪慧子　聶蘭等

摘要

[目的]采用分子生物學(xué)技術(shù)，探討貴州鳳崗富鋅富硒綠茶對小鼠抗氧化、抗衰老的作用及機制。[方法]腹腔注射D半乳糖建立小鼠衰老模型，空白組給予腹腔注射0.9%生理鹽水。造模14 d后，根據(jù)中國營養(yǎng)學(xué)會推薦每日飲茶量及實驗動物藥物劑量比例，給小鼠灌胃富鋅富硒綠茶，1次/d。連續(xù)灌胃21 d后，采用Morris水迷宮進行行為學(xué)實驗。處死小鼠，采用蛋白免疫印跡法（westernblotting）檢測各小鼠肝臟組織中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）的表達。采取RTPCR法，測定各小鼠肝臟組織中SOD和GSHPx的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。[結(jié)果]富鋅富硒綠茶對衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力有一定的改善作用，并且提高SOD和GSHPx的mRNA及蛋白質(zhì)表達水平（P<0.01）。[結(jié)論] 富鋅富硒綠茶提高機體的抗氧化能力及免疫功能，在一定程度上具有延緩衰老的作用。

關(guān)鍵詞富鋅富硒綠茶；抗氧化；超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的表達；小鼠衰老模型；肝臟組織

中圖分類號S571文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）28-09657-04

Study on Influence of Seenriched and Zincenriched Green Tea on Antioxidation and Antiaging of Mice in Guizhou

LIU Hua1， SHEN Xuehuizi1， NIE Lan2， WU Ning3*

（1. Department of Biochemistry and Molecular Biology， Guiyang Medical College， Guiyang， Guizhou 550004； 2. School of Public Health， Guiyang Medical College， Guiyang， Guizhou 550004； 3. Laboratory of Chemical and Biological Chemistry， Guiyang Medical College， Guiyang， Guizhou 550004）

Abstract[Objective] This paper focused on discussing how the Seenriched and Zincenriched green tea works on mice in antioxidation and antiaging by measuring the mRNA and protein expression level of SOD and GSHPx in liver tissue. [Method] The mice aging model was constructed by intraperitoneal injection of Dgalactose， compared with intraperitoneal injection for control group. 14 days later， the experimental mice were fed with tea solution by intragastric administration according to the daily amount of drinking tea and drug dose ratio of experimental animals recommended by Chinese Nutrition Institute. After 3week gavage， the behavior test was conducted through Morris water maze method. The mRNA expressional level of SOD and GSHPx inside the liver tissue were examined by RTPCR. The protein expression level of SOD and GSHPx inside the liver tissue were examined by westernblotting. [Result] The Se & Zincenriched green tea can exert a good influence on the improvement of the aging mices learning and memorizing ability. Meanwhile， Se & Zincenriched green tea can increase mRNA and protein expression levels of SOD and GSHPx. [Conclusion] Drinking Se & Zincenriched can improve the antioxidant capacity of mice and to an extent can slow down the aging process.

Key wordsSe & Zincenriched green tea； Antioxidant； Expression of SOD and GSHPx； Mice aging model； Liver tissue

貴州為我國綠茶的主要省份，而鳳岡產(chǎn)茶歷史悠久。唐代茶圣陸羽在他撰寫的世界第一部茶書《茶經(jīng)》八之出中記述：“黔中生思州、播州、費州、夷州……， 往往得之，其味極佳”。據(jù)考證，夷州治所就是今鳳岡縣綏陽鎮(zhèn)。宋代《華陽國志》中“平夷產(chǎn)茶蜜”，樂史《太平寰宇記》“夷州、播州、思州以茶為貢”和清代《梅移隨筆》“龍泉產(chǎn)云霧芽茶，色味雙絕”中的夷州、思州、龍泉都是指今鳳岡一帶[1]。最新科學(xué)研究表明，富鋅富硒綠茶中所含有的天然物質(zhì)成分對防衰老、防癌、抗癌、殺菌、消炎等均有特殊效果，為其他茶類所不及[2]。筆者通過測定肝臟組織中SOD和GSHPx的mRNA及其蛋白質(zhì)表達水平，研究富鋅富硒綠茶對D半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老小鼠的抗氧化、抗衰老作用，為貴州特色茶葉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和推廣提供營養(yǎng)保健的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗材料和儀器

1.1.1

動物。昆明雄性小鼠70只，體重（18～25 g），購自貴陽醫(yī)學(xué)院動物中心（合格證：10000S38）。

1.1.2

藥物。供試富硒富鋅綠茶由貴州鳳岡縣永安鎮(zhèn)田壩村所產(chǎn)，2013年春季采摘。經(jīng)貴州省山地研究所測試中心測定，該綠茶含鋅、硒含量分別是65.47±0.02、1.74±0.02 mg/kg。按茶水比為2 g∶20 ml的比例，用沸水沖泡30 min制成茶水，過濾，為高濃度組；稀釋1倍過濾后為中濃度組；再量取等體積水稀釋，過濾后為低濃度組；普通綠茶泡制方法同前；維生素C片劑，用濃度0.9%生理鹽水配制成 50 g/ml溶液。

1.1.3

試劑。D半乳糖由上海恒信化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；動物組織總RNA提取試劑盒（天根，批號DP121221）；Thermo試劑盒（Fermentas公司）；6×DNA電泳Loading Buffer上樣液（天根，批號BC110413）；溴化乙錠（EB）溶液（天根，批號BC120227）；DNA marker（北京康為世紀生物科技有限公司生產(chǎn)，批號CW0632）；濃度30%丙烯酰胺（賽蘭博，批號8080）；1.5 mol/L Tris（pH 8.8）；1.0 mol/L Tris（pH 6.8）；濃度10%SDS；濃度10%過硫酸胺（APS）；TEMED；BAC法蛋白定量試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；兔抗小鼠SOD1多克隆抗體（Santa Cruz公司，批號sc11407）；兔抗小鼠GSH1多克隆抗體（Santa Cruz公司，批號sc292189）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（Santa Cruz公司，批號sc2004）。

1.1.4

儀器。凝膠成像分析儀（美國BioRad公司），酶標(biāo)儀（美國BioTek公司），電泳儀（美國BioRad公司），3k15高速冷凍離心機（德國Sigma公司），T148 050900型PCR儀（德國Biometra公司），水平電泳儀（美國伯樂BIORAD公司），DolphinDoc凝膠成像系統(tǒng)和DolphinID軟件（美國Wealtec公司），高壓滅菌鍋（日本三洋公司），MP200A型電子天平（上海良平儀器廠），電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠），Morris水迷宮（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所），動物運動軌跡記錄分析系統(tǒng)（普升科技有限公司），HPLAS2000計算機圖像分析系統(tǒng)（無憾千屏公司）。

1.2試驗方法

1.2.1

動物衰老模型的構(gòu)建。用濃度75%乙醇消毒小鼠下腹部，用D半乳糖（0.2 mg/g小鼠體重）腹腔注射，連續(xù)14 d，誘發(fā)衰老模型，之后連續(xù)28 d每日給予相同劑量以維持衰老模型[3-4]。空白組小鼠注射濃度0.9%生理鹽水（0.1 ml/10 g小鼠體重），給藥方法同模型組。

1.2.2

行為學(xué)測試（游泳水迷宮試驗）。在連續(xù)灌胃21 d后，采用環(huán)形水池。水池中放一低于水面1 cm左右的逃避平臺。模型小鼠預(yù)先訓(xùn)練4 d，每次取1、2、3、4四個象限入水點背對站臺放入水池。若小鼠在60 s內(nèi)找到平臺，則使其停留15 s；若60 s內(nèi)未找到平臺，則將其誘導(dǎo)到平臺上，并停留15 s方結(jié)束一次訓(xùn)練。連續(xù)訓(xùn)練4 d，在第5天進行行為學(xué)測試，其檢測指標(biāo)有：①定向航行試驗，測定每只小鼠從放入水中開始到跳到逃避平臺時的時間，即逃避潛伏期；②空間探索試驗，測定每只小鼠穿越平臺區(qū)所用時間及穿越站臺次數(shù)[5-6]。

1.2.3

分組與給藥。小鼠分為空白組、衰老模型組、普通綠茶組、富鋅富硒綠茶（高、中、低劑量）組、陽性對照組（維生素C片），每組10只小鼠。 給藥方案為：給予D半乳糖（0.2 mg/g）14 d后，普通綠茶組給予普通綠茶茶水灌胃；富鋅富硒綠茶組按照高、中、低濃度進行灌胃；模型組、空白組給予等容積蒸餾水灌胃；陽性對照組灌胃1 g/L維生素C溶液，1次/d，連續(xù)給藥28 d。

1.2.4

小鼠肝臟組織SOD、GSHPx蛋白質(zhì)表達水平的檢測。提取肝臟組織總蛋白，取少量上清液進行蛋白定量，余下-20 ℃保存?zhèn)溆?，制膠，然后取20 μl蛋白質(zhì)樣品加上樣緩沖液，煮沸變性后進行SDSPAGE電泳；電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；用含濃度5%脫脂奶粉的TBST振蕩封閉2 h；分別加入適量一抗4 ℃封閉過夜，次日以TBST洗膜3次，每次10 min；加二抗，室溫振搖孵育2 h；洗膜后ECL法顯影。以βactin為內(nèi)參，條帶經(jīng)Kodok Digital Science ID Image Analysis Software及GDS1數(shù)字化凝膠成像分析儀掃描，計算吸光度（A）。

A比值=目的蛋白A/βactinA

式中，A比值為目的蛋白表達量的相對含量。試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5

小鼠肝臟組織SOD、GSHPx mRNA表達水平的檢測。用動物組織總RNA提取試劑盒提取小鼠肝臟組織總RNA，提取后取5 μl RNA對RNA純度、濃度進行檢測（提取方法嚴格按照說明書進行）。

RTPCR引物設(shè)計依據(jù)昆明小鼠中的SOD和GSHPx mRNA序列和βactin mRNA序列設(shè)計，經(jīng)blast進行特異性確定。最后，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物。SOD mRNA上游引物：5CTGTACCAGTGCAGGACCTCAT3，下游引物：5CACCTTTGCCCAAGTCATCTT3。該引物擴增的片段長度為221 bp。GSHPx mRNA上游引物：5GAAGTGCGAAGTGAATGGTGAGA3，下游引物：5AGTTGCCAGACTGCTGGGACA3。該引物擴增的片段長度為269 bp。βactin mRNA上游引物：5ATATCGCTGCGCTGGTCGTC3，下游引物：5AGGATGGCGTGAGGGAGAGC3。該引物擴增的片段長度為541 bp。

將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄（RTPCR）成cDNA，方法參考Fermentas公司RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit說明書。然后，以cDNA為模板，以SOD、GSHPx和βactin引物分別進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為：ddH2O 6 μl，2×Taq PCR MasterMix 13 μl，上下引物各1 μl，上下內(nèi)參各1 μl，模板2 μl。PCR擴增反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。產(chǎn)物在PCR反應(yīng)結(jié)束后電泳，結(jié)果掃描保存。

1.2.6

統(tǒng)計學(xué)處理。 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0系統(tǒng)軟件進行處理。計量資料采用單因素方差分析和多重比較，P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

2.1小鼠衰老模型驗證

2.1.1

小鼠外觀。研究表明，空白組小鼠體質(zhì)量正常增加；模型組小鼠從造模第28天開始，體重增加速度下降，部分毛發(fā)脫落、失去光澤，出現(xiàn)行動遲緩、精神萎靡不振等癥狀；富鋅富硒綠茶高劑量組小鼠精神狀態(tài)好于普通綠茶組；富鋅富硒綠茶中劑量組小鼠精神一直良好，毛發(fā)光滑整齊，體重增長速度正常；富鋅富硒綠茶低劑量組小鼠精神狀態(tài)略好于高劑量組小鼠；普通綠茶組小鼠表現(xiàn)與空白組相似；陽性組小鼠表現(xiàn)與中劑量組相似。

2.1.2

小鼠血清驗證。通過對比模型組與空白對照組，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血清中 MDA含量在0.05水平顯著升高，而血清中 SOD 活力、GSHPx活力、過氧化氫酶（CAT）活力顯著降低。

2.1.3

行為學(xué)測試結(jié)果。由表1可知，在定向航行試驗中，與空白組相比，模型小鼠所用的逃避潛伏期較長（P<0.01）；普通綠茶組所用的逃避時間與空白組相差不大（P>0.05）；與普通綠茶組相比，富鋅富硒綠茶組所用的逃避潛伏期較短（P<0.01）；與陽性對照組相比，富鋅富硒綠茶中劑量組所用的逃避潛伏期與之相當(dāng)（P>0.05）；與模型組相比，富鋅富硒綠茶組所用的逃避潛伏期明顯縮短（P<0.01）。在空間探索試驗中，與空白組相比，模型組第1次穿越平臺區(qū)所用時間延長，穿越站臺次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。普通綠茶組第1次穿越平臺區(qū)所用時間和穿越站臺次數(shù)與空白組相差不大（P>0.05）； 與普通綠茶組相比，富鋅富硒綠茶組第1次穿越平臺區(qū)所用時間縮短，穿越站臺次數(shù)增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與陽性對照組相比，富鋅富硒綠茶中劑量組第1次穿越平臺區(qū)所用時間和穿越站臺次數(shù)與之相差不大（P>0.05）；與模型組相比，富鋅富硒綠茶組第1次穿越平臺區(qū)所用時間縮短，穿越站臺次數(shù)明顯增多（P<0.01）。

3 討論

富鋅富硒綠茶中含有鋅和硒2種微量元素。鋅元素是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶超氧化物歧化酶的輔基；硒元素是谷胱甘肽過氧化物酶的必需成分，每摩爾GSHPx含有4 g硒原子[7-8]。因此，富鋅富硒綠茶可以為機體抗氧化物質(zhì)提供豐富的原材料。

研究表明，SOD 和GSHPx是機體抗氧化系統(tǒng)中2種重要的抗氧化酶。其中，SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，能夠有效清除自由基，減輕脂質(zhì)過氧化，保護細胞免受損傷。趙會杰等[9]通過D半乳糖所致衰老小鼠飼喂SOD蘋果，發(fā)現(xiàn)可顯著提高小鼠血清和肝臟組織的SOD、CAT和GSHPx活性，抑制脂質(zhì)過氧化，降低MDA含量。GSHPx則是機體內(nèi)重要的分解過氧化物的含硒酶。GSHPx的酶活力可以作為衡量機體硒抗氧化的能力[8]。在體內(nèi)，SOD將超氧自由基O2-轉(zhuǎn)化為H2O2，GSHPx進一步將

H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2，并且通過減少過氧化物對SOD的損害增加SOD的活性。SOD和GSHPx兩者之間明顯存在著相互保護作用和協(xié)同抗氧化作用[10]。還有研究通過測定SOD活性，推測其改善學(xué)習(xí)記憶作用可能與其提高體內(nèi)SOD活性有關(guān)[11]，其活力間接反映機體保護細胞免受損傷的抗氧化能力。

研究中，通過皮下注射D半乳糖，在體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生過量的超氧陰離子自由基O2-和H2O2，引起代謝紊亂，進而提高體內(nèi)自由基水平及過氧化體內(nèi)組織制造和自然衰老類似的亞急性衰老模型[12]。同時，以此為模型，研究貴州鳳岡富鋅富硒綠茶對小鼠的抗氧化作用。通過觀察小鼠外觀、血清學(xué)試驗和行為學(xué)測試結(jié)果，發(fā)現(xiàn)造模成功。在小鼠行為學(xué)測試中，發(fā)現(xiàn)富鋅富硒綠茶中劑量組的抗氧化作用最佳，提高小鼠的學(xué)習(xí)能力，延緩小鼠的衰老。

該試驗結(jié)果進一步表明，富鋅富硒綠茶可明顯提高D半乳糖所致衰老小鼠肝臟組織中SOD、GSHPx mRNA和蛋白質(zhì)表達水平。富鋅富硒綠茶可通過改變SOD、GSHPx的mRNA和蛋白質(zhì)表達，導(dǎo)致小鼠肝臟和血清中SOD、GSHPx含量增加，提高酶活力，在一定程度上增加抗氧化的能力，減慢細胞衰老的速度，達到改善衰老的作用?？寡趸笜?biāo)與水迷宮空間記憶能力試驗中定向航行和空間探索試驗結(jié)果相一致。另外，研究表明，中濃度富鋅富硒綠茶劑量抗氧化效果更佳，原因還有待進一步研究?？傊?，貴州鳳岡富鋅富硒綠茶具有清除自由基、抗氧化等作用，改善衰老的行為學(xué)特征，延緩衰老的進程。

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