羅帥等

摘要 [目的] 探討離子液體對(duì)斑馬魚(yú)急性毒性及保護(hù)酶活性的影響。[方法] 采用半靜態(tài)水體染毒法測(cè)定1，2-二甲基咪唑?qū)Π唏R魚(yú)的急性毒性，并對(duì)1，2-二甲基咪唑進(jìn)行了安全性評(píng)價(jià)。同時(shí)測(cè)定了不同作用時(shí)間后斑馬魚(yú)體內(nèi)不同組織（鰓、肝臟和肌肉）抗氧化酶的活性。[結(jié)果] 處理96 h后，1，2-二甲基咪唑?qū)Π唏R魚(yú)的LC50和 LC20值分別為120.815 和111.401 mg/L。1，2-二甲基咪唑（LC20和LC50）處理的斑馬魚(yú)鰓、肝臟和肌肉的CAT活性均呈現(xiàn)出先誘導(dǎo)后抑制的趨勢(shì)。1，2-二甲基咪唑（LC20和LC50）處理的斑馬魚(yú)的鰓、肝臟和肌肉的SOD活性均呈現(xiàn)出始終抑制的趨勢(shì)。1，2-二甲基咪唑（LC20和LC50）處理的斑馬魚(yú)鰓的POD活性的影響呈現(xiàn)出先誘導(dǎo)后抑制的趨勢(shì)，肝臟POD活性的影響從經(jīng)過(guò)LC20濃度處理來(lái)看呈現(xiàn)出先誘導(dǎo)后抑制的趨勢(shì)，從經(jīng)過(guò)LC50濃度處理來(lái)看呈現(xiàn)出抑制——誘導(dǎo)——抑制的趨勢(shì)，1，2-二甲基咪唑?qū)Π唏R魚(yú)肌肉POD活性呈現(xiàn)出始終抑制的趨勢(shì)。[結(jié)論] 1，2-二甲基咪唑在斑馬魚(yú)體內(nèi)積累顯著影響斑馬魚(yú)體內(nèi)CAT、SOD和POD的活性，降低斑馬魚(yú)體內(nèi)自由基的清除能力，從而對(duì)其產(chǎn)生毒害作用。

關(guān)鍵詞 1，2-二甲基咪唑；斑馬魚(yú)；急性毒性；保護(hù)酶

中圖分類(lèi)號(hào) S965.819 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）03-00786-04

Abstract [Objective] The research aimed to acute toxicity of ionic liquid to Brachydanio rerio and its effects on the activity of protective enzymes.[Method] The acute toxicity of 1，2-dimethylimidazole to .rerio was determined by semi-static toxicity test.And the safety of 1，2-dimethylimidazole was assessed.Finally the activities of antioxidant enzymes in different tissues（gill，liver and muscle） of B.rerio after different treatment time were determined.[Result] After treatment 96 h，LC50 and LC20 of 1，2-dimethylimidazole to B.rerio were 120.815 and 111.401 mg/L respectively.CAT activity in the gill，liver and muscle of B.rerio treated by LC20 and LC50 of 1，2-dimethylimidazole showed the trend of first inducement and then inhibition.SOD activity in in the gill，liver and muscle of B.rerio treated by LC20 and LC50 of 1，2-dimethylimidazole showed the trend of inhibition.The effects of LC20 and LC50 of 1，2-dimethylimidazole on POD activity in the gill of B.rerio showed the trend of first induction and then inhibition.Its effects on POD activity in the liver of B.rerio treated by LC20 of 1，2-dimethylimidazole showed the trend of first induction and then inhibition and that treated by LC50 of 1，2-dimethylimidazole showed the trend of inhibition—induction—inhibition.POD activity in the muscle of B.rerio treated by 1，2-dimethylimidazole showed the trend of inhibition.[Conclusion] The accumulation of 1，2-dimethylimidazole in B.rerio significantly affected the activities of CAT， SOD and POD in B.rerio and decreased scavenging capability of free radicals，which produced the toxic effects on B.rerio.

Key words 1，2-dimethylimidazole；Brachydanio rerio；Acute toxicity；Protective enzymes

斑馬魚(yú)（Brachydanio rerio），又名藍(lán)條魚(yú)、花條魚(yú)、斑馬擔(dān)尼魚(yú)，原產(chǎn)于印度、孟加拉國(guó)[1]，早期是用來(lái)研究胚胎發(fā)育生物學(xué)和遺傳學(xué)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[2]。由于斑馬魚(yú)擁有其他模式生物所不具備的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各領(lǐng)域[3]。近年來(lái)，人們對(duì)斑馬魚(yú)的發(fā)育生物學(xué)[4-7]、遺傳學(xué)[8-9]、腫瘤學(xué)[10]、毒理學(xué)[11-13]與環(huán)保[14-15]等方面都有研究。

離子液體（Ionic liquids）是在室溫下為液體的離子化合物，近幾年來(lái)已被開(kāi)發(fā)成一種新型的綠色化學(xué)反應(yīng)介質(zhì)[16-17]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于離子液體的研究主要集中在合成、物化性質(zhì)等領(lǐng)域[18-19]。由于離子液體的研究還處于起步階段，關(guān)于其毒性方面的報(bào)道還是很少[20-21]。因此，筆者選取離子液體1，2-二甲基咪唑（1，2-dimethylimidazole）對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行毒性試驗(yàn)，并對(duì)環(huán)境做出了安全性評(píng)價(jià)，首次探討了1，2-二甲基咪唑?qū)Π唏R魚(yú)體內(nèi)不同的組織（鰓、肝臟和肌肉）的CAT、SOD和POD抗氧化酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 供試生物

斑馬魚(yú)，體長(zhǎng)（2.3±0.2）㎝，體重（0.27±0.04）g，采購(gòu)于哈爾濱市大發(fā)市場(chǎng)。稀釋水為經(jīng)曝氣處理24 h以上的去氯自來(lái)水，pH為6.5～7.5。試驗(yàn)前，先將斑馬魚(yú)在稀釋水中馴養(yǎng)7 d，自然死亡率<10%，溫度在23～27 ℃，試驗(yàn)前1 d停止喂食，試驗(yàn)期間不喂食，試驗(yàn)用水與馴養(yǎng)稀釋水保持一致，整個(gè)過(guò)程每天給予12 h光照。

1.2 主要試劑 1，2-二甲基咪唑，購(gòu)于上海江萊生物科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、乙二胺四乙酸（EDTA）、核黃素（VB2）均購(gòu)于Amresco 公司；考馬斯亮藍(lán) G-250、甲硫氨酸（Met）、硝基氮藍(lán)四唑（NBT）、過(guò)氧化氫（Hydrogen peroxide） 、丙酮（Acetone）均購(gòu)于益世達(dá)公司；愈創(chuàng)木酚（o-methoxy phenol）購(gòu)于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.3 主要儀器 移液槍?zhuān)ㄉ虾４簖堘t(yī)療設(shè)備有限公司）；玻璃勻漿器（黑龍江省益世達(dá)實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；電子天平（美國(guó)奧豪斯）；電熱恒溫水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），高速冷凍離心機(jī)（美國(guó) Kendro 實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品公司）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)瓦里安中國(guó)有限公司）；光照培養(yǎng)箱（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；制冰機(jī)（日本三洋電機(jī)株式會(huì)社） 。

1.4 1，2-二甲基咪唑?qū)Π唏R魚(yú)的急性毒性測(cè)定 依照國(guó)家環(huán)保局化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則方法[22-23]，在試驗(yàn)24、48、72和96 h記錄斑馬魚(yú)個(gè)體死亡數(shù)，同時(shí)統(tǒng)計(jì)出致死中濃度（LC50）和亞致死濃度（LC20）及95%置信區(qū)間。

1.4.1 預(yù)試驗(yàn)。

在正式試驗(yàn)前，先用1，2-二甲基咪唑?qū)Π唏R魚(yú)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，即在5 L玻璃缸中裝入經(jīng)曝氣處理的稀釋水0.5 L，并根據(jù)所設(shè)濃度分別加入一定體積的農(nóng)藥儲(chǔ)備液，配制成5個(gè)濃度梯度，不設(shè)立平行組，用稀釋水作為空白對(duì)照。各試驗(yàn)容器中投放健康且大小一致的5尾魚(yú)，試驗(yàn)暴露周期為48 h，采用靜態(tài)方式進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，試驗(yàn)期間不換水，每日觀察記錄受試魚(yú)死亡數(shù)，并及時(shí)撈出死亡的斑馬魚(yú)。試驗(yàn)溫度為（25±2）℃，光暗周期為12 h∶12 h，試驗(yàn)期間不喂食。

1.4.2 正式試驗(yàn)。

根據(jù)1，2-二甲基咪唑在預(yù)試驗(yàn)時(shí)的結(jié)果，在正式試驗(yàn)時(shí)將1，2-二甲基咪唑按照幾何級(jí)數(shù)設(shè)置濃度梯度。在5 L的玻璃缸中裝入1 L的稀釋水，并根據(jù)所設(shè)置的濃度分別加入一定體積的農(nóng)藥儲(chǔ)備液，配置成5個(gè)濃度梯度。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行，以稀釋水作為空白對(duì)照。各容器中投放健康且大小一致的10尾魚(yú)，試驗(yàn)暴露周期為96 h，采用半靜態(tài)水體染毒法進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)期間每24 h更換一半染毒溶液，以確保離子液體暴露濃度恒定不變。試驗(yàn)溫度為（25±2）℃，光暗周期為12 h∶12 h，試驗(yàn)期間不喂食。觀察記錄24、48、72和96 h魚(yú)的死亡數(shù)與中毒癥狀，及時(shí)撈出死魚(yú)。

1.5 用于測(cè)定酶活性的斑馬魚(yú)的處理

處理方法同上。根據(jù)1，2-二甲基咪唑?qū)Π唏R魚(yú)的毒力測(cè)定結(jié)果，以96 h的LC50為基準(zhǔn)，選取丙酮液（丙酮∶蒸餾水=2∶1，V/V） 配制成母液，然后再用蒸餾水稀釋成亞致死濃度 LC20，以相同溶劑作為對(duì)照組。將健康且大小一致的斑馬魚(yú)投放至5 L玻璃缸中，每個(gè)處理15尾，每個(gè)濃度2個(gè)重復(fù)，分別暴露1、7、14和21 d后取樣，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中用于制備酶液。

1.6 酶液的制備 從每個(gè)處理組中均選取2條斑馬魚(yú)，將其鰓、肝臟、肌肉分別添加1 ml經(jīng)預(yù)冷過(guò)的提取液，置于冰浴過(guò)的玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿，在4 ℃、8 000 r/min條件下離心15 min，上清液即為酶液。

1.7 酶活性的測(cè)定 ①蛋白質(zhì)含量參照 Bradford（1976） 的考馬斯亮藍(lán) G-250法進(jìn)行測(cè)定。

②CAT活性的測(cè)定參照Cohen 等（1970） 方法，略有改進(jìn)。取30% H2O2溶液0.5 ～0.6 ml，加水至50 ml，從中取出4 ml，加入26 ml 0.05 mol/L PBS緩沖液（pH 7.0），測(cè)定其在波長(zhǎng)240 nm處的OD值。若OD值介于0.50 ～0.55，即作為過(guò)氧化氫酶的底物溶液。取3 ml配制的底物溶液，在25 ℃條件下加入粗酶液10 μl，立即用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)240 nm處每隔1 min讀數(shù)1次，每個(gè)處理重復(fù)3次。

③SOD活性的測(cè)定參照Beauchamp和Fridovich（1971）方法，略有改進(jìn)。3 ml 反應(yīng)液（含50 mmol/L pH 7.8的PBS緩沖液、13 mmol/L Met、0.1 mmol/L EDTA、75 μmol/L NBT），加入10 μl粗酶液，最后加入0.6 ml 0.5 mmol/L 核黃素，以不加酶液管作為最大光還原管，光照培養(yǎng)箱中溫度 25 ℃，三級(jí)光照下（4 000 lx） 處理20 min 后，立即避光迅速測(cè)定OD560值，每個(gè)處理重復(fù)3次。

④POD活性的測(cè)定參照陳尚文（2001） 方法，略有改進(jìn)。3 ml 反應(yīng)體系中含100 mmol/L 磷酸緩沖液（pH 6.0） 、30 mmol/L 愈創(chuàng)木酚、26 mmol/L H2O2和50 μl 酶液，反應(yīng)5 min，在波長(zhǎng)470 nm 處測(cè)定OD值。

1.8 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用 POLO軟件計(jì)算1，2-二甲基咪唑?qū)Π唏R魚(yú)的致死中濃度（LC50）和亞致死濃度（LC20） 以及95%置信區(qū)間。采用 SPSS16.0 軟件統(tǒng)計(jì)同一時(shí)間處理下不同濃度1，2-二甲基咪唑?qū)γ富钚杂绊懀捎?Duncan方法進(jìn)行顯著性分析。

3 小結(jié)

1，2-二甲基咪唑?qū)Π唏R魚(yú)低毒，正常使用時(shí)對(duì)水生生物不會(huì)造成危害。

1，2-二甲基咪唑在對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行處理時(shí)，供試斑馬魚(yú)投入到5 L玻璃缸內(nèi)初期均表現(xiàn)出不同程度的興奮癥狀，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組中有些斑馬魚(yú)身體側(cè)翻，游行動(dòng)作變得緩慢，反應(yīng)遲鈍，腹部變白，最后甚至出現(xiàn)死亡。隨著1，2-二甲基咪唑作用時(shí)間的延長(zhǎng)， LC50值均逐漸降低，表明隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，1，2-二甲基咪唑?qū)Π唏R魚(yú)的毒性逐漸增加。

在正常情況下生物體內(nèi)CAT、SOD和POD三者協(xié)調(diào)一致，處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，使自由基維持在一個(gè)低水平，而經(jīng)1，2-二甲基咪唑處理的斑馬魚(yú)，其體內(nèi)的這種平衡受到了破壞，從而使斑馬魚(yú)體內(nèi)組織產(chǎn)生了氧化損傷，最終對(duì)斑馬魚(yú)機(jī)體產(chǎn)生了毒害作用。1，2-二甲基咪唑（LC20和LC50）處理的斑馬魚(yú)的鰓、肝臟和肌肉的CAT活性均呈現(xiàn)出先誘導(dǎo)后抑制的趨勢(shì)。1，2-二甲基咪唑（LC20和LC50）處理的斑馬魚(yú)的鰓、肝臟和肌肉的SOD活性均呈現(xiàn)出始終抑制的趨勢(shì)。1，2-二甲基咪唑（LC20和LC50）處理的斑馬魚(yú)鰓POD活性的影響呈現(xiàn)出先誘導(dǎo)后抑制的趨勢(shì)，對(duì)肝臟POD活性的影響從經(jīng)過(guò)LC20濃度處理來(lái)看呈現(xiàn)出先誘導(dǎo)后抑制的趨勢(shì)，從經(jīng)過(guò)LC50濃度處理來(lái)看呈現(xiàn)出抑制——誘導(dǎo)——抑制的趨勢(shì)，1，2-二甲基咪唑?qū)Π唏R魚(yú)肌肉POD活性呈現(xiàn)出始終抑制的趨勢(shì)。1，2-二甲基咪唑?qū)τ诎唏R魚(yú)體內(nèi)的影響和作用機(jī)理是非常復(fù)雜的，僅限于對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)的變化和影響的研究是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，對(duì)1，2-二甲基咪唑還需要結(jié)合其他系統(tǒng)進(jìn)行深入研究。