陳細香 吳文杰 陳小青 柯江波
摘要[目的] 探討三丁基氯化錫(TBTCl)對僧帽牡蠣抗氧化酶系統(tǒng)毒性的影響程度及致毒機制。[方法] 在實驗室條件下,研究不同濃度(1、2、5、10和100 ng/L)的三丁基氯化錫(TBTCl)在不同暴露時間(24、72、96 h)對僧帽牡蠣消化腺和鰓的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和硒依賴谷胱甘肽過氧化酶(SeGPx)活性的影響。[結(jié)果] 當TBTCl濃度為1和2 ng/L時,在整個實驗期間TBTCl對消化腺和鰓內(nèi)SOD和SeGPx活性無顯著影響(P>0.05),而對消化腺CAT活性有顯著誘導作用(P<0.05)。當TBTCl濃度為5 ~100 ng/L時,SOD、CAT和SeGPx的活性都呈現(xiàn)不同程度的時間劑量依賴關(guān)系。[結(jié)論] 該研究可為餐桌食品污染的防患、無公害水產(chǎn)品的生產(chǎn)和環(huán)境檢測提供科學依據(jù)。
關(guān)鍵詞三丁基氯化錫;僧帽牡蠣;消化腺;鰓;SOD;CAT;Se–GPx
中圖分類號S985.3+5文獻標識碼A文章編號0517-6611(2014)04-01075-04
基金項目福建省科技廳青年科技人才創(chuàng)新項目(2008F3095);福建省高校服務(wù)海西建設(shè)重點項目(A102);碩士學位授予單位立項建設(shè)學科(生物學)。
作者簡介陳細香(1972- ),女,福建莆田人,副教授,博士,從事環(huán)境生態(tài)學研究。
有機錫化合物對海洋生物的影響越來越引起人們的廣泛關(guān)注[1-2] 。生物體內(nèi)積累有機錫,以毒性最強的三丁基氯化錫(Tributyltin chloride,TBTCl)濃度最高。由于有機錫在海洋環(huán)境中的長期殘留,即使在停止使用相當長時間后,海水和底泥中仍會存在三丁基氯化錫(TBTCl)[3] 。我國污染海域中有機錫質(zhì)量濃度從幾ng/L 到幾百ng/L不等[4]。江桂斌等[5]通過對我國沿海和內(nèi)陸水域地區(qū)的采樣測定,發(fā)現(xiàn)所有采樣點都存在有機錫的污染情況。Zhou 等[6]對我國7個城市采集的海產(chǎn)品進行了測定,均發(fā)現(xiàn)了TBTCl的存在,即使經(jīng)蒸煮烹調(diào)后TBTCl仍然存在。
三丁基氯化錫(TBTCl)的重要用途之一就是用于船體涂層添加物以防止粘附生物的增長,但同時也對牡蠣等非目標生物構(gòu)成威脅[7-9] 。筆者研究三丁基氯化錫(TBTCl)對僧帽牡蠣(Ostrea cucullata)的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、硒依賴谷胱甘肽過氧化酶(SeGPx)活性的影響,旨在探究TBTCl對僧帽牡蠣抗氧化酶系統(tǒng)毒性的影響及致毒機制,以期為餐桌食品污染的防患、無公害水產(chǎn)品的生產(chǎn)、環(huán)境檢測提供科學依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1僧帽牡蠣。試驗選用健康牡蠣,購自泉州潯埔海鮮世界大型超市,體重25.69~38.12 g,貝高2.29~2.78 cm,貝寬4.13~4.86 cm,貝長6.29~7.34 cm。試驗前將購買回來的牡蠣清除附著物,先在實驗室內(nèi)暫養(yǎng)7 d,暫養(yǎng)期間12 h換水1次,并一次性充氧30 min。試驗前選擇健康、反應(yīng)靈敏、大小基本一致的僧帽牡蠣隨機分組。試驗期間不投喂餌料。
1.1.2試劑。牛血清白蛋白(上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品)、考馬斯亮藍G250(Fluka 產(chǎn)品)、鄰苯三酚(AR)、三羥甲基氨基甲烷(Tris,AR)、鹽酸、85%磷酸、Na2HPO4·2H2O(AR)、KH2PO4(AR)、蒸餾水等。三丁基氯化錫(TBTCl),用無水乙醇溶解定容,配制母液10 μg/L,備用。實驗時,對照濃度組為含0.05 ml/L乙醇的水體。
1.2試驗方法
1.2.1染毒處理。根據(jù)環(huán)境部門規(guī)定的允許濃度[10]及污染海域環(huán)境中有機錫質(zhì)量濃度[4],設(shè)置對照組和5個濃度梯度試驗組(1、2、5、10和100 ng/L),并且分別做3組平行試驗。每個不銹鋼盆中放置30只僧帽牡蠣,充氣,記錄每組牡蠣的分泌物變化、活動狀態(tài),并及時撈出死亡牡蠣。每日更換相同濃度的污染液,試驗期間水溫23~25 ℃,pH為7.8~7.9,鹽度為32‰~34‰。分別在染毒24、72和96 h 后取樣。
1.2.2粗酶液的提取。從各染毒組中分別隨機取出牡蠣樣品6只,去掉外殼取出軟組織,用蒸餾水沖洗其軟體組織數(shù)次,并用濾紙拭干后稱重、冰浴下快速活體解剖,分別取出消化腺和鰓,以8倍體積磷酸緩沖液冰浴勻漿,4 ℃離心(12 000 r/min,30 min),將上清液置于-80 ℃冰箱中保存,待測。
1.2.3測定指標和測定方法。粗酶提取液中蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍法[11]測定,采用鄰苯三酚自氧化法測定SOD含量[12],采用紫外分光光度法測定CAT活性[13],采用熒光分光光度法測定SeGPx活性[ 14]。
1.3數(shù)據(jù)處理結(jié)果均以平均值±標準誤(Mean±S.E.)表示。采用方差分析方法分析三丁基氯化錫(TBTCl)污染引起的差異;采用Duncuns 法對組間數(shù)據(jù)進行差異性顯著分析。使用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析,使用OriginPro 7.5繪圖。
2結(jié)果與分析
2.1三丁基氯化錫(TBTCl)對僧帽牡蠣SOD活性的影響從圖1可以看出,在消化腺中SOD的活性與TBTCl濃度和暴污時間存在一定的時間劑量效應(yīng)關(guān)系。在對照組中,SOD的活性在整個試驗周期幾乎沒有變化。從整體趨勢上看,在1~100 ng/L TBTCl的脅迫范圍內(nèi),僧帽牡蠣消化腺SOD活性隨脅迫濃度的增大呈現(xiàn)出不同的變化趨勢:在24 h內(nèi),僧帽牡蠣經(jīng)低濃度(1 ng/L)的TBTCl脅迫,立即表現(xiàn)出誘導作用;當TBTC1濃度為5 ng/L時,出現(xiàn)并不明顯的抑制作用,而當染毒物濃度達到10 ng/L時,抑制作用達到顯著差異(P<0.05),當TBTC1濃度為100 ng/L時仍為顯著抑制作用,抑制率達44.8%。在72 h內(nèi),變化趨勢與24 h類似,而當TBTC1濃度到達5 ng/L時,僧帽牡蠣消化腺SOD活性回升,仍為抑制作用,但差異不顯著(P>0.05);在100 ng/L高濃度TBTCl的脅迫下,SOD活性回復至對照組水平(P>0.05)。在96 h內(nèi),低濃度TBTCl(1和2 ng/L)的脅迫下,僧帽牡蠣消化腺SOD活性受到誘導或抑制,差異不顯著(P>0.05),當TBTC1濃度為5 ng/L時表現(xiàn)為顯著抑制作用(P<0.05)。在10和100 ng/L濃度的TBTCl脅迫下,其活性回復并高于對照組,達到最大值[(54.73±0.31)U/mg]。
注:同一時間內(nèi)不同小寫字母表示各組間SOD活性差異顯著(P<0.05)。
2.3三丁基氯化錫(TBTCl)對僧帽牡蠣SeGPx活性的影響從圖3可以看出,處理24 h各濃度組下的SeGPx活性均有不同程度上升,但沒有顯著差異(P>0.05)。1 ng/L濃度組消化腺SeGPx活性在整個污染試驗過程中基本與對照組一致。處理72 h,2和5 ng/L濃度組活性顯著低于對照組(P<0.05),呈現(xiàn)抑制效應(yīng)。10、100 ng/L濃度組活性都達到最大值(P<0.05),96 h后活性小幅度下降,時間-效應(yīng)關(guān)系不顯著(P>0.05)。消化腺SeGPx活性表現(xiàn)出隨著三丁基氯化錫濃度的增加而增加的劑量一效應(yīng)關(guān)系。
注:同一時間內(nèi)不同小寫字母表示各組間SeGPx活性差異顯著(P<0.05)。
3討論
3.1三丁基氯化錫(TBTCl)對僧帽牡蠣抗氧化酶活性的影響自McCord 和Fridovich 1969 年提出生物活性氧自由基傷害學說后,該學說被廣泛運用于生物在環(huán)境脅迫下?lián)p傷機制的研究中。在正常條件下生物體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除處于一種動態(tài)平衡中,生理濃度的氧自由基不僅不會危害生物體,反而能起到一些獨特的生理作用。在某些條件(如環(huán)境理化條件變化、病害、環(huán)境污染等),生物體中自由基可大量生成,對機體造成氧化損傷。生物體中存在用于清除自由基的抗氧化系統(tǒng),由抗氧化酶和小分子抗氧化物組成。SOD、CAT和SeGPx 是生物體中最主要的3種抗氧化酶。SOD 專一催化超氧陰離子,將其歧化為H2O2和O2,H2O2可被CAT 和 SeGPx 進一步分解為H2O 和O2,從而阻止超氧陰離子轉(zhuǎn)化為活性更高的·OH,·OH 能以接近擴散極限的速度與任何可氧化的分子發(fā)生反應(yīng)。由于SOD、CAT和GPx在清除氧自由基中的重要作用,它們活性的高低可間接反映出生物體內(nèi)氧自由基含量的變化。
有機錫TBTCl不是生物體的必需元素,對生物體完全無益,是有害金屬,也是重要的環(huán)境和工業(yè)毒物,在一定濃度下,亦能產(chǎn)生毒害作用。當僧帽牡蠣處于低濃度TBTCl(1 ng/L)時,SOD、CAT和SeGPx活性上升,說明低濃度的有機錫進入僧帽牡蠣體內(nèi),刺激機體產(chǎn)生自由基,從而開始誘導清除自由基的SOD、CAT和SeGPx的合成。當僧帽牡蠣受更高濃度的TBTCl污染時,SOD、CAT和GSHPx活性變化都呈現(xiàn)出不同程度的時間劑量依賴關(guān)系。
該試驗結(jié)果表明,10 ng/L TBTCl的24 h脅迫下,消化腺中SOD和CAT活性被顯著抑制(P<0.05),僧帽牡蠣消化腺中包含肝組織,而肝是許多內(nèi)源性和外源性化合物代謝解毒的場所,而鰓是呼吸器官,幾乎沒有吞噬和解毒功能,因此鰓對TBTCl的敏感性比消化腺要低。隨著TBTC1濃度的增大,誘導程度不同,可能是因為產(chǎn)生“毒物興奮效應(yīng)”,機體的應(yīng)激系統(tǒng)和抗氧化防御系統(tǒng)能被全面激活,以清除過量的自由基,使機體免受氧化傷害,從而表現(xiàn)為SOD活力有不同程度的變化。張紅霞等[15]在有機錫離子對日本蟳血淋巴抗氧化酶(SOD、CAT、GPx)活力影響的研究表明,在低濃度有機錫離子TBTCl≤2 ng/L作用下,各處理組SOD 活力在試驗時間內(nèi)均呈激活狀態(tài),而高濃度處理組(TBTCl ≥5 ng/L)SOD 活力在暫時下降后逐漸升高,與72 h變化趨勢一樣。96 h內(nèi),在1~5 ng/L TBTCl低濃度的脅迫下,僧帽牡蠣SOD活性呈現(xiàn)先下降再顯著下降趨勢(P>0.05),表現(xiàn)為抑制作用,當在高濃度10~100 ng/L TBTC1脅迫下,進入體內(nèi)的TBTCl 增多,產(chǎn)生了大量的活性自由基,誘導SOD 活性不斷上升,且高于其他染毒組。
黃周英等[16]通過0.1、1和10 ng/L濃度三丁基錫(TBT)對文蛤鰓的抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化暴露試驗發(fā)現(xiàn),除高濃度TBT(10 ng/L)暴露在早期對CAT活性產(chǎn)生抑制外,TBT暴露對CAT活性的作用主要為誘導效應(yīng),環(huán)境水平的TBT暴露對文蛤產(chǎn)生明顯的氧化脅迫。該試驗結(jié)果表明24、72、96 h內(nèi)不同濃度的三丁基氯化錫(TBTCl)脅迫下,除了10 ng/L三丁基氯化錫(TBTCl)中強度脅迫下,在24 h內(nèi)消化腺CAT活性表現(xiàn)為顯著抑制作用,72和96 h內(nèi)消化腺CAT活性回復到與空白對照無顯著差異的水平。三丁基氯化錫(TBTCl)處理僧帽牡蠣24 h 后,在10 ng/L濃度組與0 ng/L對照組CAT活性表現(xiàn)出顯著抑制效應(yīng),隨著暴露時間的延長,逐漸與0 ng/L對照組的CAT活性接近,出現(xiàn)這種效應(yīng)可能是由于短時間的污染物暴露使酶蛋白的失活所致,此后機體的應(yīng)激性恢復了CAT的代償性機能。1、2、5和100 ng/L濃度的三丁基氯化錫(TBTCl)都對僧帽牡蠣消化腺CAT活性產(chǎn)生不同程度的誘導作用,均在100 ng/L三丁基氯化錫(TBTCl)下,活性最大。這說明在較低濃度的三丁基氯化錫(TBTCl)脅迫啟動了機體的抗氧化酶系統(tǒng),因此消化腺內(nèi)的CAT活性升高。隨著TBTC1濃度的增大,誘導程度不同,可能是因為產(chǎn)生“毒物興奮效應(yīng)”,機體的應(yīng)激系統(tǒng)、抗氧化防御系統(tǒng),能被全面激活,在自由基的誘導下,酶活力逐漸升高,以清除過量的自由基,使機體免受氧化傷害,從而表現(xiàn)為CAT活力有不同程度的升高[17]。隨著染毒時間的延長,在100 ng/L高濃度下,由于僧帽牡蠣機體內(nèi)CAT的代償性機能恢復,僧帽牡蠣內(nèi)活性氧產(chǎn)生和抗氧化系統(tǒng)的酶促反應(yīng)對活性氧清除之間可能存在較好的動態(tài)平衡,因此在100 ng/L濃度組下CAT活性呈現(xiàn)誘導作用,并達到最高值。
SeGPx的主要功能在于催化過氧化氫和有機過氧化物,也能參與清除三丁基氯化錫代謝過程中產(chǎn)生的各類自由基。該試驗結(jié)果表明,隨著僧帽牡蠣體內(nèi)三丁基氯化錫含量的提高,Se–GPx活性普遍增加。這表明有機錫污染程度的加劇已經(jīng)引起氧化脅迫。SOD、CAT、SeGPx 在功能上是相關(guān)的[18],但該試驗研究結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)三者活性的平行變化。考慮到生物體中由SOD 催化的超氧陰離子歧化并不是H2O2的唯一來源,還可以來自于氨基酸或細胞色素P450 氧化酶的反應(yīng),而SeGPx 的底物除了H2O2外還可以是有機過氧化物,SOD、CAT和SeGPx活性相關(guān)性不顯著也是可能的。
3.2海洋生物體內(nèi)有機錫的富集特點三丁基錫作為一種高效海洋殺生劑具有殺菌、殺微生物和殺蟲性能,其重要用途之一是用于船體涂層添加物,以防止粘附生物的增長,但同時也對牡蠣等非目標生物構(gòu)成威脅,能導致牡蠣生長畸形及繁殖力衰退等現(xiàn)象,曾引起世界許多地方的牡蠣養(yǎng)殖業(yè)蒙受巨大的損失。該試驗表明,三丁基氯化錫濃度為2 ng/L時能對僧帽牡蠣淀粉酶和脂肪酶活性起到較強的刺激作用,且浮游生物對有機錫有明顯的富集作用,港口附近的浮游生物體內(nèi)有機錫濃度可達670~800 ng/g(干重)[19],遠高于環(huán)境濃度。軟體動物體內(nèi)能夠累積較高濃度的有機錫。例如,貝類可以從環(huán)境中迅速吸收、富集有機錫。使體內(nèi)濃度達到22 ng/g(濕重),高于環(huán)境5 000~60 000 倍[20]。魚類體內(nèi)同樣能夠累積有機錫。Rabitto等[21]研究表明石斑魚在使用含有機錫飼料72 d后,體內(nèi)有機錫含量達到0.3 μg/ml。鳥類和哺乳動物處于食物鏈的最頂端,體內(nèi)有機錫的富集可以達到相當高的水平,海鴨肝臟中有機錫含量超過1 000 ng/g,寬吻海豚(Tursiops truncatus)肝臟中有機錫含量達到11 340 ng/g[19]。因此,必須加強養(yǎng)殖海區(qū)水質(zhì)檢測和管理。由于有機錫化合物會對環(huán)境產(chǎn)生較大影響,1974年聯(lián)合國海洋污染防治公約就將有機錫列入優(yōu)先控制的灰名單。英國政府也制定并從1987年開始執(zhí)行有關(guān)限制有機錫使用的法規(guī),有機錫環(huán)境質(zhì)量標準從1986年20 ng/L提高為1988年的2 ng/L[22]。該試驗結(jié)果表明TBTCl濃度為5 ng/L甚至1 ng/L時就會對僧帽牡蠣的抗氧化酶活性產(chǎn)生顯著影響,因此限制有機錫的排放以及制定嚴格限量標準勢在必行。
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