滕芳芳　胡曉斐　劉晨晨等

摘要[目的]探索LPS體外致人Chang Liver細胞損傷模型的建立方法和意義。[方法] 分別用20、40、60、80、100 μg/ml濃度的LPS作用Chang Liver細胞24 h，采用MTT法檢測LPS對Chang Liver細胞存活率的影響，分別測定Chang Liver細胞上清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γGT）、乳酸脫氫酶（LDH）的活性，并通過Hoechst 33258熒光染色觀察用藥24 h后Chang Liver 細胞形態(tài)的變化。[結(jié)果] 80和100 μg/ml濃度的LPS作用后Chang Liver細胞存活率顯著性降低， 胞外AST、ALT、ALP、γGT、LDH酶活性升高，細胞數(shù)目減少，細胞形態(tài)發(fā)生改變，呈現(xiàn)細胞核固縮等細胞凋亡現(xiàn)象。[結(jié)論] 用80 μg/ml的LPS與Chang Liver細胞共培養(yǎng)24 h，可以建立理想的體外肝細胞損傷模型。

關鍵詞LPS； Chang Liver細胞； AST； ALT； Hoechst 33258

中圖分類號S986.2文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）04-01071-03

基金項目國家自然科學基金面上項目（81273429）；浙江省科技廳重大專項（2013C03036，2011C02003，2011C23034）；舟山市科技計劃項目（2012C23023）。

作者簡介滕芳芳（1989- ），女，浙江舟山人，碩士研究生，研究方向：海洋功能食品、海洋藥物。*通訊作者，教授，碩士生導師，從事海洋功能食品和海洋藥物研究。

脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）是革蘭氏陰性菌細胞壁外膜的成分，其主要是由親水的多糖和疏水的類脂A組成。LPS可誘導多種細胞凋亡造成多種細胞損傷，如巨噬細胞RAW264.7、人小肺癌細胞NCLH446、神經(jīng)細胞PC12、人子宮頸癌傳代細胞Hela cell等[14]。

不同的誘因?qū)е虏煌穆愿尾?，有病毒性肝炎、成藥物性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性肝病等均能造成肝細胞損傷[5-6]，肝細胞損傷是肝病的共同病理基礎，是不同肝病的共同表現(xiàn)。因此，建立一個穩(wěn)定的肝細胞損傷模型，開展對肝細胞損傷機制的研究，有利于保肝機制的基礎研究。研究表明，LPS適合作為誘導肝損傷模型的藥物，特別是體內(nèi)LPS損傷建模已比較成熟，Debolina Nandi等用5 mg/只LPS劑量作用瑞士小鼠[7]。劉小偉等用4 mg/kg LPS劑量作用Balb/c小鼠[8]，成功建立了小鼠肝損傷模型。LPS雖多用于體內(nèi)建模的誘導劑，也可作為誘導肝細胞凋亡，但關于LPS對體外肝細胞損傷的誘導劑量尚未見報道。因此，筆者采用不同濃度LPS誘導肝細胞損傷，檢測上清液中肝損傷指標酶活性變化，并觀察誘導后肝細胞的形態(tài)變化，從而初步建立一個LPS誘導的穩(wěn)定體外肝細胞損傷模型。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。正常人肝細胞：張氏肝細胞（Chang Liver）購自中南大學湘雅醫(yī)學院細胞中心。

1.1.2主要試劑與設備。大腸桿菌脂多糖（0111：B4 LPS）、RPMI 1640、四氮唑藍（MTT），均購自Sigma公司；丙酮酸鈉購自國藥集團化學試劑有限公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；AST、ALT、ALP、γGT、LDH試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所； Hoechest 33258染料購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)。人正常肝Chang Liver細胞，用含 10%胎牛血清，加入有雙抗溶液（青霉素 G100 IU/ml、鏈霉素 100 IU/ml）、0.11 g/L丙酮酸鈉的 RPMI 1640 培養(yǎng)基，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.2.2MTT法。采用MTT法進行檢測。取對數(shù)生長期的Chang Liver細胞制成懸液，接種至96孔板，每孔200 μl，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁5 h，再加入不同濃度的LPS（20、40、60、80、100 μg/ml），每個濃度設5個平行孔，同時設立不加樣品的對照組，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，培養(yǎng)結(jié)束加入180 μl PBS 和20 μl MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再用150 μl的DMSO溶解。置于酶標儀490 nm處測定吸光度，OD值大小與活細胞成正比，每孔的實際OD值等于實測的OD值減去空白OD值。

1.2.3細胞上清液中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γGT）、乳酸脫氫酶（LDH）的活性檢測。取對數(shù)生長期的人正常肝細胞制成懸液，接種至6孔板，每孔2 ml于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)至細胞達到70%～80%，加入不同濃度的LPS，每個濃度設置3個復孔，同時設立不加樣品的對照組，24 h后取上清液使用試劑盒檢測其中AST、ALT、ALP、γGT和LDH的活性。

1.2.4細胞形態(tài)學觀察。取對數(shù)生長期的Chang Liver細胞制成懸液，接種于有預處理蓋玻片的6孔板，每孔2 ml于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24 h，制備細胞爬片，達到70% ～80%融合時去除培養(yǎng)液，加入不同濃度的LPS，同時設立不加樣品的對照組，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液后加入4%的多聚甲醛固定細胞15 min，再棄去上清加入200 μl/孔的Hoechest 33258染料溶液，在37 ℃培養(yǎng)10～20 min，然后用PBS液（pH 7.4）洗滌細胞2次，置于熒光顯微鏡下觀察Chang Liver細胞生長情況及誘導前后形態(tài)學變化。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析采用 SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果均以±s表示，組間差異采用oneway ANOVA分析，以P<0.05表示差異顯著，有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度LPS對Chang Liver 細胞活性的影響在MTT試驗中，由于酶標儀測出的實際OD值與活細胞數(shù)成正比，可以用來反映細胞損傷情況。從圖1可以看出，LPS作用24 h以后，隨著LPS濃度的增加，OD值逐漸下降，且濃度

注：*表示與陰性對照組差異顯著（P<0.05）。

2.2不同濃度LPS對Chang Liver細胞培養(yǎng)上清液中AST、ALT、ALP、γGT、LDH活性的影響由表1可知，不同濃度LPS誘導Chang Liver細胞后，隨著藥物濃度的增加AST、ALT、ALP、γGT、LDH在細胞外的濃度均隨著給藥濃度的增加而增加，細胞損傷程度隨濃度增加而加重。其中，60 μg/ml LPS組培養(yǎng)液中ALP、γGT活性與陰性對照組有顯著差異（P<0.05），80和100 μg/ml組培養(yǎng)液中AST、ALT、ALP、γGT、LDH活性與陰性對照組比較均有顯著性差異（P<0.05）。

2.3不同濃度LPS對Chang Liver細胞形態(tài)的影響通過MTT和活性試驗可以看出，LPS作用Chang Liver細胞已出現(xiàn)損傷，再進一步的細胞形態(tài)學觀察，可更直觀地看到用LPS誘導后的細胞變化情況。從圖2可以看出，在200倍熒光顯微鏡下觀察，LPS誘導24 h后對照組細胞呈均勻的藍色熒光，細胞貼壁良好且呈上皮樣舒展。隨著LPS濃度的增加，細胞損傷變重。當LPS濃度為80 μg/ml時，細胞出現(xiàn)空泡化等細胞早期凋亡現(xiàn)象。當LPS濃度為100 μg/ml時細胞數(shù)目明顯減少，同時細胞出現(xiàn)細胞核固縮、碎裂等細胞晚期凋亡現(xiàn)象。

3結(jié)論與討論

LPS也稱為內(nèi)毒素，是常見的肝損傷誘導劑。與其他的肝損傷模型（如四氯化碳、D半乳糖胺、乙醇等）相比，LPS尤其是與卡介苗聯(lián)合作用建立的肝損傷動物模型，因其造成的肝炎病變活動（肝細胞的凋亡、壞死，肝內(nèi)細胞外基質(zhì)過分沉積，大量炎細胞浸潤[9]）類似于人體慢性肝炎病變過程，因此該動物模型更是研究慢性肝病的發(fā)病機制與篩選保肝藥物的較理想模型之一[10-11]。細胞凋亡是重癥肝炎特別是病毒性肝炎發(fā)病時的特征性變化，是肝損傷的早期變化之一。研究表明LPS直接作用正常肝細胞后，肝細胞受損的原因之一就是LPS誘發(fā)了肝細胞凋亡[12-13]。因此，LPS是合適的體外肝細胞損傷模型的誘導劑，但關于LPS的作用濃度報道較少。

用LPS作用體外穩(wěn)定的肝細胞系Chang Liver細胞系，探討LPS作用濃度，建立體外肝細胞損傷模型，為下一步篩選保肝藥物的成分和濃度及其保肝機制奠定試驗基礎。經(jīng)LPS作用后，肝細胞損傷明顯，尤其是80和100 μg/ml LPS濃度作用Chang Liver細胞時，活細胞數(shù)目顯著降低（P<0.05）。在正常情況下，肝細胞的關鍵性酶AST、ALT位于肝細胞內(nèi)的線粒體中，其濃度遠遠大于其在血清中的含量，是肝細胞損傷的敏感指標之一。當肝細胞受到損傷時，細胞膜的通透性發(fā)生改變，胞內(nèi)的AST、ALT被大量釋放到細胞外。此外，肝細胞內(nèi)還存在大量的ALP、LDH、γGT，當在細胞培養(yǎng)液中被大量檢測時，也說明肝細胞膜通透性改變。在該試驗中用80和100 μg/ml的LPS作用Chang Liver細胞后細胞培養(yǎng)液中的AST、ALT濃度顯著性增加（P<0.05）。隨著LPS濃度的增加，細胞培養(yǎng)液中的ALP濃度增高，γGT、LDH被大量釋放到細胞外，說明Chang Liver細胞膜通透性改變。同時，觀察到Chang Liver細胞形態(tài)也發(fā)生了較大的改變，正常細胞呈上皮樣舒展、貼壁良好，當LPS濃度為80 μg/ml時細胞出現(xiàn)空泡化等早期凋亡現(xiàn)象。當LPS濃度為100 μg/ml時細胞數(shù)目明顯減少同時細胞出現(xiàn)細胞核固縮、碎裂等細胞晚期凋亡現(xiàn)象。據(jù)此推測，LPS濃度為80 μg/ml是比較合適的誘導劑量。當LPS濃度小于80 μg/ml時細胞活性較好，胞內(nèi)的關鍵酶也沒有被大量釋放，細胞形態(tài)學改變也較不明顯。當LPS濃度為80 μg/ml時雖有損傷，但細胞膜相對較為完整，細胞仍具有一定活性，而LPS濃度為100 μg/ml作用Chang Liver細胞后細胞已處于凋亡晚期，損傷已不可修復。注：A.對照組；B、C、D、E、F組為藥物組（LPS濃度分別為20、40、60、80和100 μg/ml）。

圖2不同濃度LPS作用Chang Liver細胞后的形態(tài)變化 （×200）綜上所述，用濃度80 μg/ml的LPS與Chang Liver細胞共培養(yǎng)24 h，可以建立理想的體外肝細胞損傷模型，為進一步研究海洋活性肽對肝細胞保護的藥物篩選研究奠定試驗模型基礎，具有較高的應用價值。

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