何瑜娜　陳代俐　童虹宇　丁奕然

摘要自1982年科學(xué)家成功轉(zhuǎn)化出首例轉(zhuǎn)基因果蠅以來，昆蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)因其潛在的廣泛應(yīng)用前景而成為研究熱點(diǎn)。昆蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)離不開標(biāo)記基因的應(yīng)用，標(biāo)記基因在篩選轉(zhuǎn)基因昆蟲個體上起到關(guān)鍵作用。經(jīng)過科學(xué)家不斷探索，轉(zhuǎn)化標(biāo)記不斷改進(jìn)。文中淺析了昆蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)中常用的轉(zhuǎn)化標(biāo)記，并對其最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為昆蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)的進(jìn)一步利用提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞 昆蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)；眼色標(biāo)記基因；抗藥性標(biāo)記基因；熒光標(biāo)記基因；可見顯性標(biāo)記

中圖分類號S188文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）04-00992-02

作者簡介何瑜娜（1993-），女，江蘇常州人，本科，專業(yè)：生物科學(xué)。*通訊作者，本科，專業(yè)：生物科學(xué)。

收稿日期20140110昆蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)，即將攜帶外源基因的DNA導(dǎo)入昆蟲的基因組中的技術(shù)，所獲得的轉(zhuǎn)基因昆蟲具有新導(dǎo)入基因表現(xiàn)型特性。已獲得成功的轉(zhuǎn)基因昆蟲有黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）、地中海實(shí)蠅（Ceratitis capitata）、岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）、家蠶（Bombyx mori）和赤擬谷盜（Tribolium castaneum）等[1]。要將轉(zhuǎn)基因昆蟲從野生型種群中快速有效地篩選出來，就要依靠轉(zhuǎn)化標(biāo)記。將轉(zhuǎn)化標(biāo)記基因和目的基因一起導(dǎo)入宿主，使轉(zhuǎn)基因個體產(chǎn)生不同的表現(xiàn)型或物化反應(yīng)，這樣就能將轉(zhuǎn)基因個體和野生型個體區(qū)分開來。理想的轉(zhuǎn)化標(biāo)記應(yīng)該滿足表達(dá)水平高、范圍大、毒副作用小和便于檢測等條件[2]。最早使用的轉(zhuǎn)化標(biāo)記是眼色標(biāo)記基因和抗藥性標(biāo)記基因，但都有一定局限性。經(jīng)過探索，科學(xué)家建立了目前使用最多的熒光蛋白標(biāo)記系統(tǒng)，并在此基礎(chǔ)上不斷發(fā)展，逐步完善。

1 眼色標(biāo)記基因

昆蟲眼色基因的突變會改變復(fù)眼的顏色，且和正常眼色易于區(qū)分。以眼色突變體作為宿主導(dǎo)入目的基因，用正常型眼色基因作為標(biāo)記基因和目的基因一起轉(zhuǎn)入宿主，在子代中篩選具有正常眼色標(biāo)志的轉(zhuǎn)基因個體就比較容易。利用這一差異，科學(xué)家成功監(jiān)測轉(zhuǎn)基因地中海實(shí)蠅。

但對許多昆蟲而言，因缺乏合適的受體突變系，從而使其利用受到限制。目前，眼色標(biāo)記基因僅應(yīng)用于果蠅、實(shí)蠅和家蠅等昆蟲。此外，突變系是近親交配，其體質(zhì)沒有野生的強(qiáng)壯，這在轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中成活率低，有礙于建立純合的轉(zhuǎn)基因品系[3]。

2 抗藥性標(biāo)記基因

抗藥性標(biāo)記基因首先在岡比亞按蚊中得到應(yīng)用，利用細(xì)菌neo基因編碼的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II作為選擇標(biāo)記，這種選擇是基于對一種氨基糖苷類抗生素抗性[4]。在野生型昆蟲中，對藥物或抗生素有抗性的種類很多，且由于染色體的位置效應(yīng)，轉(zhuǎn)化標(biāo)記的表達(dá)水平在轉(zhuǎn)化個體間也存在很大差異[3]。因此，抗藥性篩選易于出現(xiàn)假陽性或假陰性，造成篩選準(zhǔn)確率低。此外，目前很多致人類疾病的病原菌已對大部分抗生素產(chǎn)生了抗性，若再利用抗藥性標(biāo)記基因，昆蟲攜帶其極有可能會在環(huán)境中傳播和擴(kuò)散，會使目前情況更加惡化[5]。因此，抗藥性標(biāo)記基因用作轉(zhuǎn)化標(biāo)記受到一定限制。

3 熒光標(biāo)記基因

3.1GFP基因 綠色熒光蛋白（green fluorescentprotein，GFP）是一種最早從水母中分離出，能夠自身催化形成生色團(tuán)并在藍(lán)光或紫外光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光的蛋白。將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，導(dǎo)入宿主，然后在藍(lán)光或紫外光的激發(fā)下便可篩選出轉(zhuǎn)基因昆蟲個體。

GFP基因被用作昆蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的轉(zhuǎn)化標(biāo)記，存在許多優(yōu)越性。GFP在無任何底物和輔助因子情況下，就能在活細(xì)胞內(nèi)發(fā)熒光，且具有熒光穩(wěn)定、易于觀察、表達(dá)調(diào)控簡單和構(gòu)建載體方便等優(yōu)點(diǎn)。此外，GFP能與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，使表達(dá)產(chǎn)物既保持了外源蛋白的生物活性，又表現(xiàn)出熒光特性，這有利于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化和活細(xì)胞的測定，可以借助熒光顯微鏡等設(shè)備對目標(biāo)基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時示蹤；從目前的研究結(jié)果來看，GFP對目的基因的結(jié)構(gòu)功能沒有影響，對活細(xì)胞也基本無毒害，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞仍可連續(xù)傳代；由于昆蟲中本身不含有GFP，因此用GFP基因作為轉(zhuǎn)化標(biāo)記準(zhǔn)確性強(qiáng)，不會出現(xiàn)假陽性結(jié)果[6]。目前，GFP基因已在大量昆蟲中成功表達(dá)，這表明GFP在昆蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)中有著廣泛的應(yīng)用前景。

但是，野生型的GFP也存在缺點(diǎn)。比如，長時間的高強(qiáng)度激發(fā)光可能使GFP產(chǎn)生自由基，對細(xì)胞有毒害[7]。GFP有2個激發(fā)峰影響了其特異性，并且長波激發(fā)峰強(qiáng)度較小，不易觀察。GFP合成及折疊產(chǎn)生熒光的過程慢，蛋白質(zhì)折疊受溫度影響大，表達(dá)量較低[8]。另外，以錢永健為代表的眾多科學(xué)家們通過向GFP引入遺傳突變進(jìn)行改造，進(jìn)一步突變出了藍(lán)色熒光蛋白（blue fluorescent protein，BFP）、青色熒光蛋白（cyan fluorescent protein，CFP）和黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）等，進(jìn)一步擴(kuò)大了GFP的應(yīng)用[9]。

3.2EGFP基因 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced greennuoreseent protein，EGFP）是GFP的人工改造型，是通過除去GFP基因中隱蔽型內(nèi)含子、更換GFP生色團(tuán)氨基酸等方法得到的[10]。EGFP被激發(fā)后的熒光強(qiáng)度比野生型GFP高35倍。EGFP是單個吸收峰，與野生型GFP相比特異性更強(qiáng)。實(shí)際研究結(jié)果表明，以EGFP為基礎(chǔ)的標(biāo)記甚至比眼色基因還要敏感且可靠，其應(yīng)用范圍大大超過眼色標(biāo)記基因[11]。EGFP和眼色標(biāo)記基因、抗藥性標(biāo)記基因、野生型GFP基因相比，存在明顯的優(yōu)越性，已成為新一代轉(zhuǎn)基因標(biāo)記，被廣泛的應(yīng)用于昆蟲轉(zhuǎn)基因研究。

3.3精子熒光標(biāo)記 昆蟲遺傳防治是昆蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一大應(yīng)用，即讓同種昆蟲的不育成員充滿一個害蟲種群，導(dǎo)致大多數(shù)交配不能產(chǎn)生正常發(fā)育的后代，而有害基因又可以通過少數(shù)有效的交配繼續(xù)向后代傳遞，這種策略稱為不育昆蟲技術(shù)（Sterile Insect Technique，SIT）。推進(jìn)SIT計(jì)劃的關(guān)鍵就是有效地監(jiān)測、評估釋放昆蟲的數(shù)量和交配成功率。

Francesca等人報(bào)告了地中海實(shí)蠅的精子特異性標(biāo)記系統(tǒng)，這一系統(tǒng)基于特異形成精子的β2-微管蛋白（Ccβ2t）啟動子[12]，這樣就可以從轉(zhuǎn)基因個體的睪丸或精囊分離出熒光精子。轉(zhuǎn)基因精子標(biāo)記技術(shù)是一個重大的進(jìn)步，可以改進(jìn)監(jiān)測地中海實(shí)蠅SIT計(jì)劃。初步的競爭力分析表明，該標(biāo)記基本不會有缺陷。這種無害的轉(zhuǎn)基因標(biāo)記的使用，將推動昆蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)走出實(shí)驗(yàn)室。此外，有效的、易辨認(rèn)的標(biāo)記精子有可能推動地中海果蠅生殖生物學(xué)的發(fā)展，這將有助于進(jìn)一步推進(jìn)SIT計(jì)劃。

4可見顯性標(biāo)記

Mizuko等建立了可見顯性標(biāo)記系統(tǒng)，其依據(jù)是使昆蟲的黑色素發(fā)生變化，從而引起肉眼可見的表型變化[13]。家蠶中芳烷脘-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的超表達(dá)，會使初孵幼蟲的體色從黑色變成鮮明的淺棕色，整個幼蟲階段和成蟲階段，可觀察到芳烷脘-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶黑色素沉著被抑制。另外，即使第一齡幼蟲體色正常，多巴胺β-丙氨酰-合成酶基因的超表達(dá)，也會使大齡幼蟲體色變成淺棕色。進(jìn)一步研究表明，異位表達(dá)芳烷脘-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，使異色瓢蟲和果蠅的體色變淺，這表明這個標(biāo)記系統(tǒng)在不同昆蟲類群的轉(zhuǎn)基因上的潛在應(yīng)用。

由于一些昆蟲有暗色素沉著，加大了熒光檢測的難度，使得在熒光顯微鏡下大量篩選轉(zhuǎn)基因個體是一個艱苦的過程，而新建立的可見顯性標(biāo)記系統(tǒng)可以彌補(bǔ)這一不足。而且，由于黑色素廣泛存在于各種昆蟲中，這個標(biāo)記系統(tǒng)將會有比較好的應(yīng)用前景。

5小結(jié)與展望

從最初使用的眼色標(biāo)記基因和抗藥性標(biāo)記基因，到目前最常用的綠色熒光標(biāo)記基因，這幾種方法基本可以滿足昆蟲轉(zhuǎn)基因個體的篩選，而新建立的標(biāo)記系統(tǒng)在一定程度上可以彌補(bǔ)目前使用的標(biāo)記方法的不足。試驗(yàn)所述的每種標(biāo)記方法都存在不足，有待科學(xué)家進(jìn)一步研究并改進(jìn)。雖然這些標(biāo)記方法使昆蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)成為現(xiàn)實(shí)，但是標(biāo)記基因存在轉(zhuǎn)基因昆蟲體內(nèi)的安全性，仍然有待評估。

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