張永旺 張穎 張猛

（北京協(xié)和藥廠，北京 102600）

恩替卡韋原料藥中多種殘留溶劑測(cè)定方法研究

張永旺 張穎 張猛

（北京協(xié)和藥廠，北京 102600）

目的：建立恩替卡韋原料藥中殘留溶劑甲醇、乙醇、叔丁醇、叔丁基甲基醚、乙酸乙酯、四氫呋喃、正庚烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺的測(cè)定方法。方法：采用氣相色譜直接進(jìn)樣法，利用氫火焰離子化檢測(cè)器、6%氰丙基苯基-94%二甲基硅氧烷毛細(xì)管色譜柱，應(yīng)用程序升溫（40℃，保持5 min，以5℃/min的速度升溫至90℃，再以10℃/min的速度升溫至180℃，保持3 min），進(jìn)樣口溫度180℃，檢測(cè)器溫度250℃，載氣為N2，以二甲基亞砜為溶劑配制對(duì)照品溶液及樣品溶液，采用外標(biāo)法定量。結(jié)果：幾種殘留溶劑在對(duì)應(yīng)于限度的50%～150%濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系（r＝0.998 6～0.999 9）；平均回收率為90.63%～ 99.69%，RSD為0.23%～6.34%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)單、可靠、精確，可用于恩替卡韋原料藥殘留溶劑的測(cè)定。

毛細(xì)管柱氣相色譜法；恩替卡韋；殘留溶劑；原料藥

恩替卡韋為鳥(niǎo)嘌呤核苷類似物，具有高度特異性，能夠通過(guò)磷酸化成為具有活性的三磷酸鹽，通過(guò)與HBV多聚酶的天然底物三磷酸脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷競(jìng)爭(zhēng)，抑制病毒多聚酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）的所有3種活性：HBV多聚酶的啟動(dòng)；前基因組mRNA逆轉(zhuǎn)錄負(fù)鏈的形成；HBV DNA正鏈的合成[1]。恩替卡韋在我廠生產(chǎn)及前期中間體合成過(guò)程中使用了多種有機(jī)溶劑，參考已有文獻(xiàn)中殘留溶劑種類較多的氣相色譜檢測(cè)方法[2]，結(jié)合“人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）”相關(guān)文件及《中國(guó)藥典》（2010年版）二部附錄要求[3]，對(duì)恩替卡韋原料藥中殘留溶劑的測(cè)定進(jìn)行了方法摸索，建立檢測(cè)方法并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

1 材料

1.1 儀器與試藥

Agilent 7890A氣相色譜儀，G4513A自動(dòng)進(jìn)樣裝置配有Agilent操作控制及積分軟件。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：6%氰丙基苯基-94%二甲基硅氧烷毛細(xì)管色譜柱DB-624（30 m×0.53 mm，3.0 μm）；柱溫應(yīng)用程序升溫：40℃，保持5 min，以5℃/min的速度升溫至90℃，再以10℃/min的速度升溫至 180℃，保持 3 min；進(jìn)樣口溫度 180℃，進(jìn)樣體積 1 μL，分流比為 10:1；氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）溫度250℃；載氣為N2，流速：2.0 mL/min。

2.2 溶液配制

精密稱取甲醇、乙醇、叔丁醇、叔丁基甲基醚、乙酸乙酯、四氫呋喃、正庚烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺各適量，加DMSO稀釋制成每1 mL中分別含甲醇300 μg、乙醇500 μg、叔丁醇500 μg、叔丁基甲基醚 500 μg、乙酸乙酯 500 μg、四氫呋喃72 μg、正庚烷 500 μg、甲苯 89 μg、N，N-二甲基甲酰胺88 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

取樣品約 0.2 g，精密稱定，置 2 mL量瓶中加DMSO振搖使溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液。

3 結(jié)果

3.1 專屬性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，按 2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，通過(guò)色譜工作站計(jì)算系統(tǒng)適用性參數(shù)，各溶劑間分離度均大于1.5（見(jiàn)表1）。

表1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果

3.2 線性試驗(yàn)

正是初夏的清夜，摘星樓中燈火堂皇。谷中烏桕既多，燈油也不值錢哪。東方宇軒召集七圣諸客卿，坐在這幾張?zhí)茨疽紊?，鄭重其事地議事，一年上頭也沒(méi)有幾回。山外縱然是戰(zhàn)鼓興起，血海茫茫，能奈我谷中習(xí)藝修道人何？但這已經(jīng)是東方宇軒去年的想法了，再高的山，再深的洞，千山萬(wàn)水，也無(wú)法將人與世界隔離開(kāi)來(lái)，何況萬(wàn)花谷已經(jīng)是一個(gè)小世界了，外面的大世界天翻地轉(zhuǎn)，我們這幾個(gè)人憑著一點(diǎn)癡念建立起來(lái)的小世界，又如何能波瀾不興呢？

精密稱取甲醇70.41 mg、乙醇97.87 mg、叔丁醇 99.20 mg、叔丁基甲基醚 95.22 mg、乙酸乙酯110.25 mg、四氫呋喃14.88 mg、正庚烷101.06 mg、甲苯17.86 mg、N，N-二甲基甲酰胺19.49 mg置100 mL量瓶中，用DMSO稀釋至刻度，搖勻，作為線性貯備溶液。分別量取貯備溶液2.5，3.0，4.0，5.0，6.0，7.5 mL置10 mL量瓶中，用DMSO稀釋至刻度，搖勻，備用。按色譜條件方法測(cè)定，以測(cè)得峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，各成分進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，計(jì)算各溶劑的回歸方程，見(jiàn)表2。

上述結(jié)果表明，各個(gè)溶劑在一定濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

3.3 回收率試驗(yàn)

取恩替卡韋 0.2 g，精密稱定，置 2 mL量瓶中，用DMSO溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為樣品溶液。另分別精密稱取恩替卡韋樣品0.2 g 6份置2 mL量瓶中，作為加樣回收率試驗(yàn)的樣品；再精密稱取甲醇70.13 mg、乙醇97.21 mg、叔丁醇99.06 mg、叔丁基甲基醚 100 mg、乙酸乙酯 107.86 mg、四氫呋喃14.14 mg、正庚烷84.01 mg、甲苯17.18 mg、N，N-二甲基甲酰胺 19.16 mg置 100 mL量瓶中，作為貯備液，分別量取貯備液0.8，1.0，1.2 mL置所對(duì)應(yīng)的樣品瓶中，作為80%、100%、120%濃度的溶液，用DMSO稀釋定容至刻度，搖勻。每份濃度溶液平行制備3份，計(jì)算回收率，見(jiàn)表3。

表2 恩替卡韋殘留溶劑線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 恩替卡韋殘留溶劑回收率 （%）

3.4 精密度試驗(yàn)

精密量取100%對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果各殘留溶劑峰面積RSD均小于5%。

3.5 定量限、檢測(cè)限試驗(yàn)

以DMSO為空白，記錄在甲醇等溶劑出峰時(shí)間范圍內(nèi)儀器的噪聲水平。分別取甲醇、乙醇、叔丁醇、叔丁基甲基醚、乙酸乙酯、四氫呋喃、正庚烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺各適量，精密稱定，配制成適宜濃度母液，采用逐步稀釋后進(jìn)樣，計(jì)算S/N=3以及S/N=10時(shí)的濃度。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 恩替卡韋殘留溶劑定量限、檢測(cè)限 （μg/mL）

3.6 樣品測(cè)定

取3批恩替卡韋各約0.2 g，精密稱定后分別置于2 mL量瓶中，分別加 DMSO溶液稀釋至刻度，照色譜條件方法測(cè)定，結(jié)果3批樣品（批號(hào)20130901、20131001、20131002）在甲醇、乙醇、叔丁醇、叔丁基甲基醚、乙酸乙酯、四氫呋喃、正庚烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺色譜峰相應(yīng)位置上均未顯明顯色譜峰。

4 討論

根據(jù)我廠生產(chǎn)恩替卡韋所涉及的合成路線，叔丁醇為合成工藝中的可能降解雜質(zhì)，為了嚴(yán)格控制產(chǎn)品質(zhì)量，將叔丁醇也列入了殘留溶劑考查范圍。氣相色譜法檢測(cè)殘留溶劑常用到的溶劑有DMSO以及N，N-二甲基甲酰胺等，考慮到恩替卡韋合成過(guò)程中使用到的溶劑，首選DMSO作為溶劑，通過(guò)多個(gè)色譜條件的摸索，保證了DMSO溶劑對(duì)其他檢測(cè)溶劑的測(cè)定沒(méi)有干擾，最終選擇DMSO作為溶劑。

色譜柱首先選用HP-5毛細(xì)管柱，采用頂空的方法測(cè)定甲醇、乙醇、叔丁醇、叔丁基甲基醚、乙酸乙酯、四氫呋喃、正庚烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺的混合樣品，結(jié)果表明N，N-二甲基甲酰胺響應(yīng)值小，并且與甲苯出峰位置重合；改變初始溫度（60℃、100℃、150℃、40℃）和升溫程序，仍然無(wú)法調(diào)節(jié)N，N-二甲基甲酰胺響應(yīng)值，也無(wú)法實(shí)現(xiàn)與甲苯的有效分離。結(jié)合氣相色譜圖庫(kù)的方法，使用DB-624毛細(xì)管柱，調(diào)節(jié)程序升溫，上述溶劑均可以有效分離，但 N，N-二甲基甲酰胺響應(yīng)值仍然較低，考慮到N，N-二甲基甲酰胺沸點(diǎn)很高，采用直接進(jìn)樣代替頂空進(jìn)樣。由于涉及溶劑的極性和沸點(diǎn)差異較大，通過(guò)不同升溫程序的比較，以40℃保持5 min，后以5℃/min的速度升溫至90℃，可以保證沸點(diǎn)較低的溶劑（甲醇、乙醇等）分離度符合規(guī)定；再以 10℃/min的速度升溫至180℃，保持3 min，能保證其他各殘留溶劑的準(zhǔn)確分離，故采用了此程序升溫條件。 與文獻(xiàn)[4-5]所報(bào)道的恩替卡韋原料藥溶劑殘留檢測(cè)方法比較，此方法涉及到的殘留溶劑種類多，由于溶劑沸點(diǎn)的差別，進(jìn)樣方式直接進(jìn)樣好于頂空進(jìn)樣，此條件下殘留溶劑出峰均在溶劑出峰之前，易于樣品檢測(cè)，避開(kāi)了溶劑峰之后出峰存在有干擾的可能，能準(zhǔn)確檢測(cè)出恩替卡韋中的殘留溶劑。結(jié)果表明此方法簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好。

[1] 張麗旦，石小楓.拉美夫定與恩替卡韋治療乙型肝炎的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007，23（24）：3708-3709.

[2] 呂亞光，呂昭云，安信生，等.恩曲他濱原料藥揮發(fā)性雜質(zhì)的研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2013，42（3）：150-153.

[3] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典（2010年版）二部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄31-32.

[4] 樓永軍.毛細(xì)管柱氣相色譜法測(cè)定恩替卡韋中8種殘留溶劑[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，23（1）：56-57.

[5] 李祥勝，楊瑾.氣相色譜法測(cè)定恩替卡韋原料藥中有機(jī)溶劑殘留量[J].安徽醫(yī)藥，2012，16（11）：1594-1596.

◆醫(yī)藥快訊◆

FDA批準(zhǔn)造影劑Florbetaben F 18上市

美國(guó)FDA于2014年3月19日批準(zhǔn)Piramal Imaging公司的Florbetaben F 18（商品名：Neuraceq）注射液上市，作為正電子發(fā)射斷層掃描（PET）成像的造影劑，用于對(duì)正接受阿爾茨海默?。ˋD）和其他認(rèn)知功能降低原因診斷的成人患者進(jìn)行腦成像，以估算β-淀粉樣蛋白神經(jīng)炎性斑塊密度。

本藥通過(guò)與β-淀粉樣斑塊結(jié)合，產(chǎn)生PET可掃描的正電子信號(hào)。使用本藥掃描結(jié)果為陰性顯示大腦中沒(méi)有或有少量神經(jīng)炎性斑塊，患者認(rèn)知障礙可能與AD無(wú)關(guān)；掃描結(jié)果為陽(yáng)性顯示大腦中有一定量或較多的神經(jīng)炎性斑塊，此種情況可能出現(xiàn)在AD、其他精神疾病患者或認(rèn)知功能正常老人中，本藥僅可作為其他診斷的輔助手段。在體外，本藥顯示對(duì)合成的β-淀粉樣纖維及AD腦均漿有納摩爾級(jí)別的親和性。另外，尸檢結(jié)果也顯示本藥對(duì)β-淀粉樣蛋白神經(jīng)炎性斑塊的親和性。

本藥對(duì)PET的敏感性和特異性通過(guò)一項(xiàng)主要臨床試驗(yàn)證明。試驗(yàn)結(jié)果顯示，采用本藥進(jìn)行PET成像鑒別患者腦部β-淀粉樣蛋白神經(jīng)炎性斑塊顯示高特異性和高敏感性。

本藥最常見(jiàn)的不良反應(yīng)包括注射部位疼痛、刺激。

（來(lái)源：http://www.fda.gov）

Determination of Residual Solvents in the API of Entecavir

Zhang Yongwang，Zhang Ying，Zhang Meng（Beijing Union Pharmaceutical Factory，Beijing 102600，China）

Objective：To establish a method for the determination of residual solvents of methanol，ethanol，tert-butanol，methyl tert-butyl ether，ethyl acetate，tetrahydrofuran，n-heptane，toluene and N，N-dimethyl formamide in the API of entecavir.Methods:FID detector and 6%cyanopropyl phenyl-94%two methyl siloxane capillary chromatographic column were adopted with capillary gas chromatography method.Standard solution and test solution were introduced by direct injection.The injector temperature was at 180℃and the detector temperature was at 250℃. The column temperature was programmed raised （at 40℃ for 5 min，at the speed of 5℃/min up to 90℃，then at the speed of 10℃/min up to 180℃ for 3 min）.The carrier gas was nitrogen，and the solvent was DMSO.The residual solvents were quantified by external standard method.Results:The correlation coefficients of linearity ranged from 0.998 6 to 0.999 9 for the organic residual solvents within the concentration of 50%to 150%of relative individual limit specified.The average recovery rate was 90.63% ～99.69%，RSD was 0.23%～6.34%.Conclusion:This method was simple，reliable and accurate for the quantitative determination of residual solvents，and can be used for the quality control of the API of entecavir.

Capillary Gas Chromatography；Entecavir；Residual Solvent；Active Pharmaceutical Ingredient（API）

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.05.004

2014-02-20）

張永旺，男，助理工程師。研究方向：藥物分析。E-mail：iamzhyw@126.com

張猛，男，博士，副高級(jí)工程師。研究方向：藥物化學(xué)。通訊作者E-mail：zhangm05@yahoo.com