許諾 吳天一 王國棟 袁同洲 黃野

經(jīng)驗(yàn)交流

納米殼聚糖纖維強(qiáng)化型磷酸鈣骨水泥的研究*

許諾 吳天一 王國棟 袁同洲 黃野*

目的探討納米殼聚糖纖維強(qiáng)化型磷酸鈣骨水泥的機(jī)械及生物相容性能。方法使用納米殼聚糖纖維強(qiáng)化CPC骨水泥，通過MTT比色法及DAPI染色觀察其生物相容性情況；通過三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)檢測其力學(xué)性能。結(jié)果三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)表明經(jīng)過殼聚糖纖維強(qiáng)化后的骨水泥的機(jī)械性能（17.3±4.5）MPa較之普通骨水泥有明顯改善（5.3±1.4）MPa；并且這樣的改進(jìn)對材料的生物相容性沒有影響，其毒性試驗(yàn)顯示新材料相容性比值為（97.5±3.3）%。細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)3天吸光值分別為（0.237±0.025）、（0.451±0.015）、（0.726±0.032）。結(jié)論新型納米殼聚糖纖維強(qiáng)化型骨水泥無細(xì)胞毒性，具有良好的機(jī)械性能及生物相容性。

磷酸鈣骨水泥；強(qiáng)化；殼聚糖纖維

骨缺損的常見原因有：創(chuàng)傷、骨病理性改變、感染、骨腫瘤治療等[1,2]。其中大段、大塊骨缺損是目前骨科臨床的治療難點(diǎn)之一。目前臨床上骨替代材料種類很多，如羥基磷灰石、硫酸鈣人工骨、磷酸鈣骨水泥（CPC）等。其中磷酸鈣骨水泥由于其生物相容性好、操作方便等優(yōu)勢，得到了廣泛關(guān)注。但大段磷酸鈣骨水泥人工骨的研制是組織工程的難點(diǎn)，難點(diǎn)集中于人工骨可吸收替代性與強(qiáng)度的矛盾關(guān)系。人工骨的生物學(xué)性能要求人工骨要有較高的孔隙率以允許細(xì)胞和體液的進(jìn)入以便于人工骨的吸收，而力學(xué)性能則要求人工骨植入初期，需要有良好的力學(xué)性能以保證其成骨空間。但CPC由于機(jī)械化性能較差不能構(gòu)建大段人工骨或僅能應(yīng)用在非負(fù)重區(qū)[3-5]。

一些研究者對CPC進(jìn)行強(qiáng)度能力的改進(jìn)。研究者通過在CPC粉末中加入殼聚糖或明膠，想達(dá)到了強(qiáng)化其機(jī)械性能的目的[3]。但單純將殼聚糖粉劑與CPC混合并不能提高CPC力學(xué)性能[6]。我們將殼聚糖制成纖維絲，并與CPC混合，期望能提高該新型CPC的力學(xué)強(qiáng)度，并同時(shí)評估其的生物相容性。

1 材料與方法

1.1 納米殼聚糖磷酸鈣骨水泥的制作

磷酸鈣骨水泥購買自上海Rebone公司。殼聚糖（分子量150000）購買自浙江元化生物技術(shù)公司。直徑300～400nm的納米殼聚糖絲的制作由華東理工大學(xué)高分子材料學(xué)院完成。試驗(yàn)分為三組：CPC骨水泥（CPC）；改進(jìn)型骨水泥通過納米殼聚糖絲（F-CPC）（均勻切成9.5mm的短絲）按照9.5%的體積分?jǐn)?shù)與CPC粉末均勻混合；普通的殼聚糖粉末（C-CPC）也按照相同的體積分?jǐn)?shù)與CPC骨水泥進(jìn)行混合。使用聚乙酸樹脂模子（直徑10mm，高度5mm）將三組磷酸鈣骨水泥壓制成大小相同的小圓片用于細(xì)胞毒性試驗(yàn)。使用聚乙酸樹脂模子（直徑10mm，高度25mm）將三組磷酸鈣骨水泥壓制成大小相同的小圓柱用于材料強(qiáng)度試驗(yàn)。

1.2 材料毒性試驗(yàn)及細(xì)胞擴(kuò)增試驗(yàn)

小鼠成纖維細(xì)胞系L929被用來進(jìn)行材料的毒性及細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)的研究。細(xì)胞毒性試驗(yàn)通過對材料的浸提液的檢測進(jìn)行。DMEM培養(yǎng)液用來對材料進(jìn)行浸提液的制作，浸提液的制作按照ISO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。L929細(xì)胞按照1.5×103/ml的濃度在材料表面培養(yǎng)24小時(shí)后將培養(yǎng)液換為材料浸提液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。MTT（Sigma公司，St Louis,MO）方法被用來檢測材料的毒性，5mg/ml的MTT溶液被加入培養(yǎng)板37°C條件下孵育4小時(shí)后去除培養(yǎng)基。經(jīng)過MTT反應(yīng)的結(jié)晶溶解于DMSO，溶液的吸光度（A560nm）通過分光光度計(jì)（Perkin-Elmer）進(jìn)行檢測。細(xì)胞的擴(kuò)增試驗(yàn)同樣應(yīng)用L929細(xì)胞進(jìn)行測試，細(xì)胞以10000個(gè)/ml的濃度接種于材料表面，在經(jīng)過1、2、3天培養(yǎng)后對其進(jìn)行MTT檢測以測定其增值情況。同時(shí)24小時(shí)培養(yǎng)后的樣品在經(jīng)過PBS漂洗后進(jìn)行DAPI（Sigma公司，St Louis,MO）染色，對通過10分鐘DAPI溶液染色后的樣品進(jìn)行熒光顯微鏡觀察照相，其結(jié)果與之前的MTT結(jié)果共同構(gòu)成材料學(xué)的生物相容性檢測。

1.3 材料強(qiáng)度測試

材料的強(qiáng)度通過力學(xué)三彎曲試驗(yàn)進(jìn)行測試。三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)的測試參數(shù)設(shè)計(jì)為：全長20mm，彎曲速度0.5mm/min。材料明顯形變或斷裂時(shí)所承受的最大力作為材料的最大彎曲強(qiáng)度（MPa）[7]。

2 結(jié)果

2.1 材料毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

材料的毒性通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞在材料浸提液中的增值情況得出（圖1）。細(xì)胞在各種材料浸提液中MTT檢測得出的A值與使用普通DMEM培養(yǎng)液測出的A值進(jìn)行比較，所得出的比例按照以下指標(biāo)進(jìn)行檢測：強(qiáng)（<30%）；較強(qiáng)（30%～60%）；中等（60%～90%）；無毒性（>90%）。試驗(yàn)結(jié)果：CPC組（91.3±3.1）%；C-CPC組（90.1±11.7）%；F-CPC組（97.5±3.5）%（圖1）。3種材料均沒有表現(xiàn)出明顯的毒性。

圖1 材料毒性試驗(yàn)。圖中可見幾種材料均不顯現(xiàn)出毒性

2.2 細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)胞在材料表面的增值情況通過MTT實(shí)驗(yàn)（圖2）與對材料表面粘附細(xì)胞的熒光染色（圖3，彩圖見插頁）共同檢測。從MTT的A值結(jié)果（表1）中可見，3種材料對于3天時(shí)間內(nèi)細(xì)胞的增值并沒有明顯差異。DAPI染色為細(xì)胞核染色，L929細(xì)胞的細(xì)胞核在熒光顯微鏡下顯現(xiàn)出藍(lán)色熒光。圖2和圖3中表現(xiàn)出細(xì)胞在3種材料表面的粘附增值情況無明顯差異。

表1 3組材料的MTT的A值結(jié)果

圖2 1、2、3天材料表面細(xì)胞增值情況，在3天時(shí)間內(nèi)，材料表面細(xì)胞增值情況沒有明顯差異

圖3 材料表面細(xì)胞增值24小時(shí)后細(xì)胞核熒光染色情況，L929的細(xì)胞核在DAPI染色后顯現(xiàn)出藍(lán)色熒光（A：CPC,B：C-CPC,C：F-CPC）

2.3 材料力學(xué)性能測試

三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)被應(yīng)用來檢測材料的機(jī)械性能（圖4）。不同材料的機(jī)械性能由材料的最大彎曲強(qiáng)度（MPa）來表示（表2）。由試驗(yàn)可見經(jīng)過殼聚糖絲強(qiáng)化的CPC材料（F-CPC）的強(qiáng)度均得到了有效的改善。而使用殼聚糖粉末進(jìn)行改進(jìn)的CPC骨水泥（C-CPC）強(qiáng)度與普通CPC骨水泥沒有明顯差異。

表2 3組材料最大彎曲強(qiáng)度

圖4 材料力學(xué)性能測試，較之未加入殼聚糖絲強(qiáng)化的普通CPC和CCPC，F(xiàn)-CPC的強(qiáng)度明顯得到改善。（P＜0.05）

3 討論

CPC具有良好的生物相容性與生物降解性，是臨床較為常用的骨替代材料；并且由于其良好的操作性能，近些年對其的使用也越來越廣泛。但其較低的力學(xué)強(qiáng)度使其僅能應(yīng)用在骨的“非受力區(qū)域”。所以，我們認(rèn)為CPC在改進(jìn)過程中應(yīng)著重對其機(jī)械性能進(jìn)行改進(jìn)，從而使其更好的應(yīng)用在骨科手術(shù)過程中。

有研究者使用不同種類的纖維與CPC混勻來改善CPC的強(qiáng)度,如聚磷酸鈣纖維、納米碳管纖維等，以往的研究發(fā)現(xiàn)加入纖維材料后對CPC的強(qiáng)度都有增強(qiáng)[3]；在使用這樣的方法對CPC強(qiáng)度進(jìn)行改進(jìn)時(shí)，選用纖維的種類、纖維長短以及纖維所占比例均會對最終的力學(xué)強(qiáng)度造成影響[8]。但此類纖維需具備滿意的生物相容性和生物可降解性[9]。由于殼聚糖本身具有良好的生物相容性，使用其作為原料進(jìn)行電紡絲加工后的殼聚糖纖維很好的繼承了其原有的生物相容性的特點(diǎn)。通過本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過殼聚糖纖維強(qiáng)化的CPC（FCPC）力學(xué)強(qiáng)度普遍比普通CPC及混合殼聚糖粉的CPC（CCPC）有明顯提升。因此，這種可吸收纖維大大加強(qiáng)了CPC可吸收性骨水泥的機(jī)械性能。

殼聚糖作為一種天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等優(yōu)良性能被各行各業(yè)廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖也可以復(fù)合納米羥基磷灰石，用于骨組織工程修復(fù)[10]。大量的研究證實(shí)混合殼聚糖的CPC，具有良好的生物相容性，并且可被降解[11,12]。本研究結(jié)果也表明使用殼聚糖纖維強(qiáng)化的CPC在強(qiáng)度上較之普通CPC及殼聚糖粉強(qiáng)化的CPC有明顯改善，并且使用這種方法改進(jìn)的骨水泥具有較好的生物相容性。但該骨水泥顯微結(jié)構(gòu)特性和體內(nèi)降解性和成骨性能還需進(jìn)一步研究。

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A new strength-reinforced calcium phosphate cements

ObjectiveTo evaluate the mechanical behavior of the new calcium phosphate bone cement（CPC）.MethodsThe CPC was reinforced by chitosan fiber. The strength of the samples was investigated by a standard three-point bending test.Cell toxicity and proliferation of cells were also invested.ResultsThe results of three-point bending test also showed the incorporation of chitosan fiber（17.3±4.5）MPa significantly increased the mechanical strength of CPC（5.3±1.4）MPa.And the reinforcement is not harmful to the biocompatibility of CPC.Extracts of new bone cement showed noncytotoxic（97.5±3.3）%.TheMTT activity of cells is（0.237±0.025）,（0.451±0.015）,（0.726±0.032）during3 days cultured.ConclusionCPC combined with chitosan fiber can meet the needs of strength and biocompatibility.

CPC bone cement;Reinforcement;Chitosan fiber

R318.08

B

許諾（1977-）男，本科，主治醫(yī)師。研究方向：骨折創(chuàng)傷與修復(fù)。

*[通信作者]黃野（1957-）男，本科，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。研究方向：骨與關(guān)節(jié)創(chuàng)傷修復(fù)。

2013-08-15

南京醫(yī)科大學(xué)?；痦?xiàng)目（2010NJMU092）

南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江蘇南京，210011