單 迪 鄭吉龍 任 鵬 李 軍

（中國刑警學(xué)院 遼寧 沈陽 110035）

微量血痕中18SrRNA與ACTBmRNA變化的時(shí)間規(guī)律性研究

單 迪 鄭吉龍 任 鵬 李 軍

（中國刑警學(xué)院 遼寧 沈陽 110035）

制備不同時(shí)間的血痕樣品，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測不同時(shí)間點(diǎn)18SrRNA和ACTB mRNA含量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在10周內(nèi)，隨血痕經(jīng)過時(shí)間延長，18SrRNA基因片段和ACTBmRNA基因片段發(fā)生了較明顯降解，具有一定的時(shí)間規(guī)律性。18SrRNA基因片段較ACTB mRNA降解速度快。采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測18SrRNA和ACTBmRNA含量變化，為推斷血痕經(jīng)過時(shí)間提供了新的方法和客觀依據(jù)。

實(shí)時(shí)定量PCR 血痕形成時(shí)間 18SrRNA ACTB 降解

血痕作為犯罪現(xiàn)場最常見的物證，其形成時(shí)間往往與犯罪發(fā)生時(shí)間密切相關(guān)。血痕經(jīng)過時(shí)間的研究國內(nèi)外均有報(bào)道，這也一直是法醫(yī)學(xué)界尤其是法醫(yī)病理學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量PCR的實(shí)驗(yàn)技術(shù)對血痕中的18SrRNA與ACTBmRNA變化進(jìn)行定量檢測，以探索用實(shí)時(shí)定量PCR推斷血痕經(jīng)過時(shí)間的可行性方法。

1 材料和方法

1.1 檢測血樣的制備

選取健康成年男性、女性各20名（年齡在18～20歲之間）的靜脈血，分別滴于載玻片上，每張載玻片滴5μL，制作成血痕，置室內(nèi)環(huán)境(不遮蔽光線)。除1個(gè)對照組于取血后即刻取材外，其余以放置時(shí)間不同，隨機(jī)分為8個(gè)實(shí)驗(yàn)組，即分別放置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周組，每組20張玻片。實(shí)驗(yàn)期間室內(nèi)環(huán)境變化不加以人為控制，每周監(jiān)測并記錄室內(nèi)溫、濕度具體變化情況。

1.2 模板DNA的提取、純化

采用手術(shù)刀片將載玻片上制備的待檢血痕刮下，收集到1.5mL EP管中。每個(gè)樣品管加500μL裂解液，離心2000～3000rpm，30s，加入10μL蛋白酶K（10mg/mL）。樣品室溫孵育40min，中間輕輕震蕩，肉眼觀察到其成茶色，50℃孵育40min，中間每管追加10μL蛋白酶K。孵育過程中輕輕震蕩混勻，至肉眼觀血渣全部溶解。將樣品放入70℃加熱器上裂解35min，中間輕輕震蕩混勻。每個(gè)樣品加入磁珠30μL震蕩血樣、裂解液和磁珠的混合液，使其充分接觸反應(yīng)8min。將樣品高速震蕩后，快速放置到磁力架上，靜置1～2min，可觀察到磁珠立刻吸附到管壁靠近磁力架的一側(cè)，用移液器小心吸棄管中液體，中間注意不要震動(dòng)磁珠。每個(gè)樣品管加入裂解液300μL，高速震蕩，洗滌磁珠，洗滌1～2min后將管放到磁力架上，待磁珠吸附到一側(cè)管壁后，用移液器小心吸棄管內(nèi)液體。此步重復(fù)2次，共洗滌3次。第3次洗液洗滌后，將樣品管管蓋打開，室溫?fù)]發(fā)管內(nèi)殘存液體，持續(xù)時(shí)間5～20min。每管加入溶解液350μL，將樣品管放到65℃加熱塊上，反應(yīng)8～10min，洗脫磁珠吸附的DNA。震蕩混勻磁珠與洗脫液的混合液，將樣品管放到磁力架上，用移液器將洗脫液轉(zhuǎn)移到標(biāo)記好的新EP管中。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測

1.3.1 引物和探針設(shè)計(jì)合成

引物和探針為AB公司設(shè)計(jì)合成，引物序列和探針結(jié)合序列詳見表。

表 待檢基因位點(diǎn)18SRNA與ACTB的引物序列和探針結(jié)合序列

1.3.2 real time PCR實(shí)驗(yàn)方法

Stage1∶AmpErase UNG活化。50.0℃ 2min，Ramp Rate∶Auto，Reps∶1。

Stage2：AmpliTaq Gold DNA聚合酶活化95.0℃10min，Ramp Rate∶Auto，Reps∶1。

Stage3：PCR擴(kuò)增（共40個(gè)循環(huán)） 95.0℃ 15s (溶解)，60℃ 1min(退火／延伸)，Reps∶40。

1.4 數(shù)據(jù)檢測與分析

反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)入 result窗口的擴(kuò)增曲線（amplification plot）頁面，選擇自動(dòng)分析（Auto Ct），查看自動(dòng)分析的實(shí)驗(yàn)圖譜。此次反應(yīng)所有標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)幾乎落在一條直線上，此次絕對定量的數(shù)據(jù)結(jié)果可信。同時(shí)采用用EXCEL軟件對18SrRNA和ACTB mRNA隨著時(shí)間的延長的參數(shù)值變化規(guī)律進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，做線性回歸，得出相關(guān)系數(shù)，獲得回歸方程。

2 結(jié)果

2.1 18SrRNA基因位點(diǎn)隨時(shí)間降解變化

在10周的時(shí)間范圍內(nèi)，一定的環(huán)境條件下，血痕中的18SrRNA的相對含量隨時(shí)間延長而逐漸下降。第10周時(shí)幾乎檢測不到血痕中的18SrRNA的相對含量。

2.2 ACTB基因位點(diǎn)隨時(shí)間降解變化趨勢

ACTB降解變化趨勢：ACTB基因位點(diǎn)的降解變化基本同18SrRNA基因位點(diǎn)相同。

2.3 人血痕經(jīng)過時(shí)間與18SrRNA相對含量的變化趨勢回歸分析

在10周的時(shí)間范圍內(nèi)，一定的環(huán)境條件下，血痕中的18SrRNA的相對含量隨時(shí)間延長而逐漸下降。第10周時(shí)幾乎檢測不到血痕中的18SrRNA的相對含量。經(jīng)EXCEL軟件相關(guān)分析，女性和男性18SrRNA的相對含量與時(shí)間決定系數(shù)（R2）分別為為0.903和0.9374，18SrRNA的相對含量隨著時(shí)間的延長而呈下降趨勢，兩者之間存在著較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)，18SrRNA的相對含量與時(shí)間具有密切相關(guān)關(guān)系，回歸方程見圖1、圖2。

圖1 20名女性血痕經(jīng)過與18SrRNA相對含量的變化趨勢回歸分析

圖2 20名男性血痕經(jīng)過時(shí)間與18SrRNA相對含量的變化趨勢回歸分析

2.4 人血痕經(jīng)過時(shí)間與ACTBmRNA相對含量的變化趨勢回歸分析

在10周的時(shí)間范圍內(nèi)，一定的環(huán)境條件下，血痕中的ACTBmRNA的相對含量隨時(shí)間延長而逐漸下降，其下降趨勢與 18SrmRNA基本相同，但18SrRNA基因片段較ACTBmRNA基因片段降解速度快。第10周時(shí)幾乎檢測不到血痕中的ACTBRNA的相對含量。經(jīng)EXCEL軟件相關(guān)分析，女性和男性ACTBmRNA的相對含量與時(shí)間決定系數(shù)（R2）分別為0.8285和0.7603，ACTBmRNA的相對含量隨著時(shí)間的延長而呈下降趨勢，兩者之間存在著較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)，ACTBmRNA的相對含量與時(shí)間具有密切相關(guān)關(guān)系，回歸方程見圖3、圖4。

圖3 20名女性血痕經(jīng)過時(shí)間與ACTBmRNA相對含量的變化趨勢回歸分析

圖4 20名男性血痕經(jīng)過時(shí)間與ACTBmRNA相對含量的變化趨勢回歸分析

3 討論

2002年至今，國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)報(bào)道了使用流式細(xì)胞儀、計(jì)算機(jī)圖像技術(shù)檢測組織細(xì)胞中DNA降解變化推斷細(xì)胞離體時(shí)間的方法，但存在DNA降解檢測靈敏度低、準(zhǔn)確率低，在不同的實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)性差、研究時(shí)間范圍局限在一周內(nèi)等缺點(diǎn)。按照理論假設(shè)，不同體積的血痕中DNA總量不同，但18SrRNA基因位點(diǎn)與ACTB基因位點(diǎn)的相對含量應(yīng)該是穩(wěn)定的，因而可以應(yīng)用檢測二者Ct比值變化推測血痕形成時(shí)間。本研究使用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測10周內(nèi)血痕，發(fā)現(xiàn)隨血痕經(jīng)過時(shí)間的延長，RNA總量逐漸降解，18SrRNA相對于β-actin mRNA含量隨時(shí)間延長逐漸下降。提示本研究利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測方法具有靈敏度高、精確性高的優(yōu)點(diǎn)，能夠檢測出微量DNA檢材并且精確的檢測出其含量，因而可以對較長時(shí)間降解程度較嚴(yán)重的血痕DNA進(jìn)行定量分析，從而拓寬了時(shí)間推斷范圍。

本研究表明在10周內(nèi)，一定的環(huán)境條件下，血痕中18SrRNA和β-actinmRNA隨時(shí)間發(fā)生了降解變化。本實(shí)驗(yàn)選擇的兩段特異性DNA片段18SrRNA基因片段和ACTB基因片段隨時(shí)間的延長均發(fā)生了較明顯降解，但18SrRNA基因片段較ACTB基因片段降解速度快。18SrRNA和β-actinmRNA是廣泛存在于各種真核細(xì)胞生物的一類看家基因，其序列功能高度保守且表達(dá)數(shù)量豐富。18SrRNA在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含量豐富，一個(gè)細(xì)胞內(nèi)有數(shù)千拷貝。且?guī)缀跏菃为?dú)存在于由多個(gè)小核糖體組成的復(fù)雜的核糖體蛋白合成物中，如同DNA分子外表有組蛋白保護(hù)。18SrRNA可以隔絕RNA酶和其他化學(xué)因子對其自身的侵襲，使得18SrRNA可以在細(xì)胞未破損或核糖體未裂解時(shí)保持相對穩(wěn)定。而成熟β-actinmRNA主要也游離在胞質(zhì)中，含量不如18SrRNA豐富，且容易降解，半衰期短。通過電子顯微鏡觀察，這種多聚結(jié)合體并不十分緊密，中間有明顯空隙，這樣易于受到外界環(huán)境干擾，穩(wěn)定性較差。因此，18SrRNA和β-actinmRNA均為本研究提供了合適的實(shí)驗(yàn)樣本。

為了更接近實(shí)戰(zhàn)，本實(shí)驗(yàn)并沒有嚴(yán)格控制可能影響血痕降解過程的溫度、濕度、光照強(qiáng)度等室內(nèi)環(huán)境因素，以求模擬實(shí)際案例中室內(nèi)現(xiàn)場的血痕，并探索在多個(gè)條件變量的綜合作用下，定量檢測到血痕降解變化的可行方法。實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果標(biāo)明，該方法可以客觀反映現(xiàn)實(shí)環(huán)境中血痕18SrRNA與ACTB的時(shí)間變化規(guī)律。當(dāng)然，無法判斷其中任一因素變化，對血痕降解變化的具體影響。今后的研究，可以固定其中多個(gè)變量，研究單一變量對血痕降解的影響，獲得更系統(tǒng)的數(shù)據(jù)變化規(guī)律，來支持該方法在血痕經(jīng)過時(shí)間推斷中理論和實(shí)踐應(yīng)用。

[1]鄭吉龍，李曉娜，張曉東，等.應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳測定人血痕淋巴細(xì)胞降解的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2007，22(3).

[2]Johnson LA，F(xiàn)erris JA.Analysis of postmortem DNA degradation by single-cell gel electrophroesis (SCGE)[J].ForensicSciInt.2002，126(1).

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（責(zé)任編輯：于 萍）

D913

A

2013-12-26

公安部重點(diǎn)研究計(jì)劃項(xiàng)目（編號：2011ZDYJXJXY005）。

單迪（1980-），男，遼寧沈陽人，中國刑警學(xué)院講師，碩士，主要從事法醫(yī)學(xué)研究。