王相忍

（河南省濮陽市食品藥品檢驗所，河南 濮陽 457000）

阿魏酸鈉為非肽類內(nèi)皮素受體拮抗劑，可拮抗內(nèi)皮素引起的血管收縮、升壓及血管平滑肌細胞增殖；可增加一氧化氮(NO)的合成，松弛血管平滑??；抑制血小板聚集、抗凝血、改善血液流變學(xué)特征；抑制膽固醇的合成，調(diào)血脂。阿魏酸鈉氯化鈉注射液主要用于動脈粥樣硬化、冠心病、腦血管病，亦可用于偏頭痛，血管性頭痛的治療。其起效快，對輕、中、重各型患者均有效，是偏頭痛的治本藥物。筆者對阿魏酸鈉氯化鈉注射液細菌內(nèi)毒素檢查法的可行性進行了探討。

1 儀器、試藥與動物

ZH－2型自動漩渦混合器（天津藥典標準儀器廠）；TAL－40D型試管恒溫儀（湛江安度斯生物有限公司）。阿魏酸鈉氯化鈉注射液（河南天方華中藥業(yè)有限公司，批號為13032006，12040903，12101701，12101101；福建天泉藥業(yè)股份有限公司，批號為12101101；規(guī)格均為 100 mL含阿魏酸鈉 0.1 g與氯化鈉0.9 g)；鱟試劑（簡稱 TAL，湛江安度斯生物有限公司，批號為1301262，規(guī)格為 0.1 mL，靈敏度為 0.25 EU /mL；湛江博康海洋生物有限公司，批號為1209030，規(guī)格為 0.1 mL，靈敏度為0.25 EU/mL）；細菌內(nèi)毒素工作標準品（簡稱CSE，中國食品藥品檢定研究院，效價為100 EU/支，批號為150601－201176）；細菌內(nèi)毒素檢查用水（簡稱BET用水，湛江安度斯生物有限公司，批號為1207310，規(guī)格為2 mL）。家兔品種為日本大耳白兔（河南省實驗動物中心提供）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度（λ）的復(fù)核

按2010年版《中國藥典（二部）》附錄ⅪE的要求[1]對鱟試劑靈敏度進行了復(fù)核，結(jié)果見表1。所使用的鱟試劑靈敏度測試值（λc）均在 0.5 ～ 2.0 λ之間，符合規(guī)定。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果

2.2 供試品細菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

根據(jù)公式 L＝K/M，K為每人每千克體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑 K＝5 EU/（kg·h），M為每人每千克體重每小時的最大供試品劑量[1]，參照阿魏酸鈉氯化鈉注射液說明書，最大使用劑量為100 mL/h，成人體重按60 kg，則 L＝3 EU/mL。對于體積在100 mL以上（包括100 mL）的復(fù)方靜脈輸液類品種，內(nèi)毒素限值一般按0.5 EU/mL[2]。因此，將本品的 L定為0.5 EU /mL。

2.3 供試品干擾預(yù)試驗

目前，國產(chǎn)鱟試劑靈敏度范圍一般在 0.5～0.03 EU /mL，則樣品的最大稀釋倍數(shù)（MVD）＝CL/λ＝16。采用不超過最大稀釋倍數(shù)的1，2，4，8，16 倍的溶液，記為 NPC；另制備同一系列濃度并含有2 λ細菌內(nèi)毒素的樣品陽性溶液，記為PPC。用 λ為0.25 EU/mL的兩廠家TAL[2－3]，分別與上述NPC和PPC系列溶液進行反應(yīng)，每一濃度重復(fù)2管，并設(shè)陰性對照（NC）和陽性對照（PC）各2管。結(jié)果見表2?？梢姡?dāng)樣品稀釋2倍時，對兩個廠家TAL均不存在干擾作用。

表2 阿魏酸鈉氯化鈉注射液干擾預(yù)試驗結(jié)果

2.4 供試品干擾試驗

根據(jù)預(yù)干擾試驗結(jié)果，取2個廠家的4批號樣品制成稀釋2倍的供試品溶液。用供試品溶液和BET用水分別將內(nèi)毒素工作標準品稀釋成 2，1，0.5，0.25 λ 的系列溶液，然后分別用 λ 為0.25 EU/mL的兩廠家TAL，進行正式干擾試驗[2]。結(jié)果見表3。內(nèi)毒素標準品水溶液反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（ES）均在0.5～2.0 λ范圍內(nèi)，內(nèi)毒素供試品溶液反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（Et）均在0.5～2.0 Es范圍內(nèi)。結(jié)果表明，在此試驗條件下，樣品對TAL與細菌內(nèi)霉素的反應(yīng)無干擾。

表3 阿魏酸鈉氯化鈉注射液干擾試驗結(jié)果

2.5 樣品細菌內(nèi)毒素檢查

取4個批號供試品，照預(yù)干擾試驗稀釋方法制成稀釋2倍的溶液，用 λ為 0.25 EU/mL 2廠家不同 TAL，以 L為 0.5 EU /mL作為評定標準，按檢查法進行操作和結(jié)果判斷。結(jié)果見表4。可見，4個批號樣品經(jīng)不同廠家的TAL檢驗，均符合規(guī)定。

表4 阿魏酸鈉氯化鈉注射液細菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

2.6 熱原試驗驗證

取上述4個批號的樣品，進行家兔法（10 mL/kg）熱原檢查試驗，結(jié)果均符合規(guī)定。

3 討論

現(xiàn)行的質(zhì)量標準中采用傳統(tǒng)的家兔法檢查熱原，成本高、時間長、影響因素多、靈敏度低。細菌內(nèi)毒素檢查法具有較家兔熱原檢查法靈敏、快速、簡便易行、重現(xiàn)性好、結(jié)果準確等優(yōu)點。采用2批不同廠家的鱟試劑對4批樣品進行方法學(xué)驗證試驗，結(jié)果表明，當(dāng)樣品稀釋2倍時對鱟試劑與細菌內(nèi)毒素的反應(yīng)無干擾作用，方法學(xué)驗證結(jié)果也符合細菌內(nèi)毒素檢查法有效性的規(guī)定。建議積累更多的數(shù)據(jù)后，將該品種的細菌內(nèi)毒素檢查法（凝膠法）載入國家標準中。

參考文獻:

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄99.

[2]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:310.

[3]肖貴南，孫清萍，盛英美.如何建立新藥的細菌內(nèi)毒素檢查方法[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，8（32）:159 －161.