嘎拉沁·滿都拉, 上井幸司，湯口實，巖佐達郎*

(1. 內蒙古師范大學 化學與環(huán)境科學學院，內蒙古 呼和浩特0100022；2. 室蘭工業(yè)大學，日本 北海道室蘭050-8585)

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HPLC-MS/MS法同時測定生藥梔子主要成分

嘎拉沁·滿都拉1,2, 上井幸司2，湯口實2，巖佐達郎2*

(1. 內蒙古師范大學 化學與環(huán)境科學學院，內蒙古 呼和浩特0100022；2. 室蘭工業(yè)大學，日本 北海道室蘭050-8585)

目的：建立梔子中主要活性成分京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷同時進行定性定量分析方法。方法：采用HPLC-MS/MS質譜聯(lián)用技術，同時測定梔子水提取液中主要成分。質譜條件為電噴霧離子源，正離子檢測，掃描范圍10～1000(m/z)；色譜測定使用ACE C8(100mm×2.1mm,5μm)色譜柱，以甲醇-水梯度洗脫，流速0.2mL· min-1，檢測波長240nm，柱溫30℃。結果：梔子中確定了京尼平苷、京尼平龍膽二糖苷和羥異梔子苷等3種成分；在定量分析中主要成分京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷均在0.1～100μg·mL-1濃度范圍內具有良好的線性關系(r=1.000 00和r =0.999 98)。結論：HPLC-MS/MS法對梔子中主要成分可準確、快速、同時進行定性定量分析，對生藥梔子的質量控制提供了參考依據(jù)。

梔子；HPLC-MS/MS；京尼平苷；京尼平龍膽二糖苷

梔子(Gardenia jasminoides Ellis)是茜草科(Rubiaceae)植物梔子，其干燥成熟果實，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒等功效[1]。其化學成分主要含環(huán)烯醚萜類成分，如京尼平苷(geniposide)、京尼平龍膽二糖苷(genipingentiobioside)、羥異梔子苷(gardenoside)、京尼平苷酸(geniposidic acid)等[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，梔子具有抗炎、抗氧化、利膽、利尿、抗腫瘤、解熱、鎮(zhèn)痛、輻射防護、降血脂等多種藥理活性，已成為目前研究的熱點[3]。

HPLC/MS/MS技術在中藥化學成分、質量標準以及指紋圖譜研究中具有獨特的優(yōu)勢[4,5]。目前，已有的研究是對梔子中梔子酸、京尼平苷(梔子苷)、西紅花苷、京尼平等進行HPLC含量測定[6-9]，或者對梔子的化學成分進行定性分析[10-12]，而用色譜法與質譜法同時測定梔子中京尼平苷、京尼平龍膽二糖苷和羥異梔子苷進行定性和定量分析的研究未見相關報道。筆者采用高效液相色譜質譜聯(lián)用法同時測定梔子中化學活性成分，并對其色譜峰保留時間、一級和二級掃描質譜圖與對照品比較，對京尼平苷、京尼平龍膽二糖苷進行了定性定量分析。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

島津高效液相色譜儀Prominence LC-20A (日本SHIMADZU公司)，液相色譜質譜聯(lián)用儀API2000 LC/MS/MS三重四極桿質譜系統(tǒng)(美國AB SCIEX公司)，數(shù)控式超聲波細胞粉碎器，SONOPULS UW2070, BANDELIN，高速大容量冷卻離心機7780(日本KUBOTA)，Milli-Q超純水裝置(美國Millipore公司)，紫外可見光分光光度計UVmini-1240(日本島津)。

1.2 試劑

流動相用甲醇為色譜純，日本(Wako)；蒸餾水為HPLC用蒸餾水；對照品京尼平苷，日本(Wako)，批號00007070-212；對照品京尼平龍膽二糖苷，四川省維克奇生物科技，批號130527；梔子(購于內蒙古藥店)。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備

對照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷分別配置1mg·mL-1的水溶液和1∶1的混合對照品儲備溶液，使用前再稀釋100倍。

2.2 供試品溶液制備

生藥梔子研細，過60目篩，精密稱取粉末0.5g，加超純水10mL，超聲 (70W、20kHz) 提取30min，高速離心機離心(3 000rpm)20min，上清液經0.45μm微孔濾膜過濾，即得。HPLC測定時將供試品溶液再稀釋1 000倍后使用。

2.3 色譜、質譜條件

色譜條件：色譜柱：ACE C8(100mm×2.1mm,5μm)色譜柱；流動相：甲醇-水溶液(梯度洗脫)；流速：0.2mL/min；檢測波長：240nm；柱溫：30℃；進樣量：0.5μL。

質譜條件:電離源：電噴霧離子源 (ESI)；掃描模式：正離子檢測(positive)；掃描范圍：10～1100(m/z)；毛細管電壓(IS)：LC-MS為5 500 V; MS/MS為4 500 V; 霧化器壓強：LC-MS為50 psi; MS/MS為17 psi；干燥器溫度：300 ℃；碎片電壓：120 V。實驗數(shù)據(jù)用AB SCIEX公司Analyst 1.4.2軟件處理。

2.4 結果

2.4.1 定性分析(質譜測定) 取供試品梔子水溶液，注入質譜聯(lián)用儀API2000，進行MS測定。測得質譜圖中主要峰的質量電荷比分別為410.9 m/z,amu、572.7 m/z,amu和426.9 m/z,amu，見圖1。

分別取對照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷溶液注入質譜聯(lián)用儀API2000，進行MS測定。測得對照品京尼平苷(分子量388.1)和京尼平龍膽二糖苷(分子量550.2)的質量電荷比分別為410.8 m/z,amu(M+Na=388.1+22.7 )和572.9 m/z,amu(M+Na=550.2+22.7)，見圖2 A、B。對照品的準離子峰進行MS/MS測定，二級質譜碎片離子中分別測得質荷比(22.8±0.5)m/z,amu的離子(圖略)，推斷為Na離子。

圖1 梔子提取液質譜總離子流

圖2 對照品質譜

2.4.2 定量分析(液相色譜) 取供試品梔子水溶液，京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的混合對照品溶液各0.5μL注入高效液相色譜儀中，進行HPLC-MS測定。供試品色譜圖中峰1、峰2和峰3的保留時間分別為15.23min、14.16min和11.71min(圖3A)，其中峰1和峰2與對照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的保留時間完全吻合(見圖3B)。

2.5 線性關系考察

精密吸取對照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的溶液，用超純水配制分別為0.1、1、5、50、100 mg·mL-1等不同濃度的對照品溶液，每個濃度平行進樣測定3次。以對照品濃度C(mg·mL-1)為橫坐標，以色譜峰峰面積Y為縱坐標制作標準曲線。求得京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的直線回歸方程及相關系數(shù)(r)分別為：

Y=22863X-1045.2 r=1.000 00

Y=18471X-3431.9 r=0.999 98

圖3 對照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的混合溶液HPLC圖譜

京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷均在0.1～100mg·mL-1濃度范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系，分析方法學效能指標滿足定量分析方法驗證要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，室溫下放置，照“2.3”項下分別于制備后0、2、4、6、8、10、12h 進樣0.5μL。結果京尼平苷的平均峰面積為68 500，RSD為 0.21%，京尼平龍膽二糖苷的平均峰面積為7 417，RSD為 1.22%。表明供試品溶液在12h內穩(wěn)定性良好。

2.7 精密度試驗

準確吸取供試品溶液，每次進樣0.5μL，連續(xù)進樣5次。測得京尼平苷平均峰面積的RSD為 0.18%，京尼平龍膽二糖苷平均峰面積的RSD為 0.70%。表明本辦法精密度良好。

2.8 重復性試驗

按“2.3”項下方法平行制備梔子供試品溶液6份，分別進樣0.5μL，測定色譜峰面積，用外標法計算含量，求得京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的平均含量(n=6)分別為4.84%，RSD為0.96%和1.20%，RSD為0.47%，表明該方法重復性良好。

2.9 加標回收率

精密吸取供試品溶液，分別添加1.0ppm濃度的對照品混合溶液，進樣0.5μL進行測定。每個添加水平測定5次，京尼平苷的平均加樣回收率和RSD分別為 109.13%和0.30%；京尼平龍膽二糖苷的平均加樣回收率和RSD分別為94.49%和0.31%。

2.10 含量測定

按“2.3”項下方法制備梔子的供試品溶液6份，分別精密吸取供試品溶液和混合對照品溶液各0.5μL，注入HPLC

儀，測定色譜峰峰面積，外標法計算含量，測得京尼平苷平均含量為4.842%，RSD為0.96%；京尼平龍膽二糖苷平均含量為1.1976%，RSD為0.47%。

3 討論

本實驗對樣品進行水、甲醇和甲醇-水混合溶液(50∶50)等不同溶劑進行提取，對比結果表明水提取液測得成分含量較高。分光光度計進行200～650nm波長掃描，對照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的最大吸收峰分別為238nm和239nm，因此后續(xù)試驗采用240nm檢測波長進行兩種成分同時檢測。液相色譜柱子分別使用C18和C8柱子，均能測得樣品的活性成分，但C8柱子更能提高效率，故選擇C8柱子。

生藥提取液是包含多個化學成分的極其復雜的混合物。色譜法很難同時檢測其所有化學成分。質譜檢測器可以很好地解決這個問題，它對生藥的多種成分均能夠檢測。本文采用HPLC-MS/MS質譜聯(lián)用技術所建立的生藥梔子中京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷含量測定方法高效、準確、全面地評價其活性成分，在生藥研究及質量控制方面是一個可行的方法。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010：231-232.

[2] 顏升，董艷凱，陳健，等．中藥梔子的研究現(xiàn)狀[J].安徽農業(yè)科學，2013，41(18):7759-7760，7772.

[3] 孟祥樂,李紅偉,李顏，等．梔子化學成分及其藥理作用研究進展[J].中國新藥雜志,2011,20(11):959-967.

[4] 朱國元,陳光英,李慶洋，等．HPLC/MS/MS技術在中藥白花前胡成分鑒定中的應用[J].中國天然藥物，2004，2(5):304-308

[5] 金郁,肖珊珊,孫毓慶.高效液相色譜/二極管陣列檢測/質譜/質譜(HPLC/DAD/MS2)聯(lián)用在板藍根注射液成分鑒定中的應用[J]．色譜,2003,21(6):558-561.

[6] 朱琦,吳炳忠,沈曉霞.產地和采收時間對梔子中梔子苷含量的影響[J].中藥研究與信息,2012(7):18-20.

[7] 沈晨,吳虹,吳歡,等.超高效液相色譜法測定生梔子和焦梔子藥材中梔子苷含量[J].安徽中醫(yī)學院學報,2012,31(2):56-58.

[8] 黃群蓮,唐燦,張彥燕,等.高效液相色譜法測定江津梔子中梔子苷含量[J].中國藥業(yè),2011,20(11):20-22.

[9] 何兵，田吉，李春紅，等．瀘州納溪GAP基地梔子中4種主要活性成分的含量測定[J].中成藥，2009，31(12)：1884-1887.

[10] 王曉燕，張麗，王添琦，等．梔子化學成分的UHPLC-Q-TOFMS分析[J]．中藥材，2013,36(3)：407-410.

[11] 左月明，張忠立，楊雅琴，等．梔子化學成分研究[J]．中藥材，2013,36(2)：225-227.

[12] 付小梅，侴桂新，王崢濤，等．梔子的化學成分[J]．中國天然藥物，2008，11(6):418-420.

(責任編輯：王尚勇)

2014-01-26

內蒙古自然科學基金項目(2011MS0204)；室蘭工業(yè)大學重點研究項目(國際合作)

嘎拉沁·滿都拉(1968-)，男，蒙古族，工學博士，內蒙古師范大學講師，研究方向為蒙藥、天然藥化學成分。

巖佐達郎，日本室蘭工業(yè)大學教授，博士生導師。

R284.1

A

1673-2197(2014)08-0027-03